Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6261:1997 ISO 6730:1992 (E) Sữa - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 6,5ºC

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6261:1997

SỮA - ĐỊNH LƯỢNG ĐƠN VỊ HÌNH THÀNH KHUẨN LẠC TỪ CÁC VI SINH VẬT ƯA LẠNH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 6,5^oC

Milk - Enumeration of colony-forming units of psychrotrophic micro-organisms - Colony-count technique at 6,5^oC

TCVN 6261 : 1997 hoàn toàn tương đương với ISO 6730 : 1992 (E);

TCVN 6261 : 1997 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ vi sinh vật ưa lạnh trong sữa nguyên liệu và sữa đã xử lý nhiệt bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 6,5^oC.

2. Tiêu chuẩn trích dẫn

lSO 7218 : 1985 Vi Sinh vật học - Hướng dẫn chung về kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) Sữa và các sản phẩm sữa - Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh.

ISO 707 : 1985 Sữa và các sản phẩm sữa - Các phương pháp lấy mẫu.

TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725) Độ chính xác của các phương pháp thử nghiệm - Xác định độ lặp lại và độ tái lập cho phương pháp thử chuẩn bằng các phương pháp thử của liên phòng thí nghiệm.

3. Định nghĩa

Áp dụng định nghĩa sau đây trong tiêu chuẩn này:

3.1. Vi sinh vật ưa lạnh - Các vi khuẩn, nấm men và nấm mốc dưới các điều kiện qui định trong tiêu chuẩn này tạo thành các khuẩn lạc có thể đếm được.

4. Nguyên tắc

4.1. Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy, sử dụng môi trường nuôi cấy và một lượng mẫu thử xác định. Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, với các dung dịch pha loãng thập phân từ mẫu thử.

4.2. Nuôi ấm các đĩa 10 ngày, trong môi trường có không khí ở 6,5^oC.

4.3. Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc từ các vi sinh vật (CFU) trong 1 mililít mẫu thử từ số khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng sao để có được kết quả thoả đáng.

5. Dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

5.1. Khái quát

Hướng dẫn chung, xem ISO 7218.

5.2. Nguyên liệu chính

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

5.3. Chất pha loãng để dùng cho các mục đích chung

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

5.4. Phân phối, khử trùng và bảo quản

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989).

5.5. Môi trường nuôi cấy

5.5.1. Thành phần

5.5.2. Chuẩn bị

5.5.2.1. Chuẩn bị từ môi trường hoàn chỉnh khô thương phẩm

Tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nhưng trong mọi trường hợp, phải cho thêm sữa bột gầy ngay cả khi nhà sản xuất coi việc thêm như vậy là không cần thiết.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng, pH là 7,0 ở 25^oC.

5.5.2.2. Pha chế từ các thành phần chính khô

Hòa tan và phân tán trong nước theo trình tự sau: cao men, tripton, glucôza và cuối cùng là sữa bột gầy.

Chú thích 1 - Nước được hâm nóng sẽ giúp cho việc hòa tan tốt hơn.

Cho thêm thạch và đun sôi, khuấy đều cho đến khi thạch tan hoàn toàn, hoặc đun nóng trong nồi hơi nước trong khoảng 30 phút.

Chú thích 2 - Nếu dung dịch không trong thì lọc qua giấy lọc. Nếu cần, chỉnh pH, sao cho sau khi thử trùng pH là 7,0, ở 25^oC.

5.5.2.3. Phân phối, khử trùng và bảo quản

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (6.9) với các lượng từ 12 ml đến 15 ml trong mỗi ống, hoặc vào bình cầu hoặc chai (6.9) với các lượng từ 100 ml đến 150 ml.

Khử trùng bằng nồi hấp (6.1) ở 121^oC ± 1^oC trong 15 phút. Nếu môi trường dùng ngay thì làm nguội đến 45^oC trong nồi cách thủy (6.5). Nếu không dùng ngay, trước khi bắt đầu tiến hành thử nghiệm vi sinh, để tránh mọi sự chậm trễ khi rót môi trường, làm tan chảy hoàn toàn môi trường trong nồi cách thủy nóng (6.6) sau đó làm nguội đến 45oC trong nồi cách thủy (6.5).

(Xem 8.4.4).

Bảo quản môi trường đã chuẩn bị ở chỗ tối với nhiệt độ từ 0^oC đến +5^oC không quá ba tháng.

Chú thích 3 - Để kiểm tra được nhiệt độ của thạch, đặt một nhiệt kế vào một lượng dung dịch 15 g/l thạch được đựng trong một bình riêng biệt giống hệt loại bình để đựng môi trường. Dung dịch kiểm tra nhiệt độ này phải được tiến hành các thao tác tương tự về đun nóng và làm nguội, giống như đối với môi trường nuôi cấy.

6. Thiết bị

Chú ý - Phải khử trùng tất cả các dụng cụ tiếp xúc với mẫu thử, với chất pha loãng, với dung dịch hoặc với môi trường nuôi cấy phù hợp với TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), (6.1 ).

Chú thích 4 - Có thể dùng các dụng cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thuỷ tinh có thể sử dụng nhiều lần, nếu như nó phù nợp với các yêu cầu qui định.

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử và các dung dịch pha loãng theo qui định của TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 :1989) và đặc biệt là:

6.1. Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực), xem ISO 7218.

6.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 6,5^oC ± 0,5^oC.

6.3. Đĩa Petri bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.4. Pipét chia độ, được nhét bông ở đầu, đã hiệu chỉnh dung tích 1 ml ± 0,02 ml, hoặc 10 ml ± 0,2 ml, hoặc 11 ml ± 0,2 ml.

6.5. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động ở 45^oC ± 1^oC.

6.6. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động từ 100^oC trở lên.

6.7. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm một bộ phận chiếu sáng có nền đen, được gắn với một kính lúp có độ khuếch đại 1,5 lần và có một dụng cụ đếm cơ hoặc điện tử.

6.8. pH mét bù nhiệt, có độ chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH ở 25^oC.

6.9. Ống nghiệm có dung tích khoảng 20 ml (hoặc bình hoặc chai có dung tích thích hợp) và các bình cầu hoặc chai có dung tích từ 150 ml đến 250 ml dùng để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy.

Chú thích 5 - Có thể dùng chai hoặc bình cầu có nắp xoáy bằng kim loại không độc.

7. Lấy mẫu

Lấy mẫu theo ISO 707.

8. Cách tiến hành

Chú thích 6 - Để tăng độ chính xác của phương pháp, việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng phải được chuẩn hóa cẩn thận. Những yếu tố tác động đến độ chính xác là:

- Kiểu loại thiết bị khuấy trộn;

- Thời gian khuấy trộn;

- Dịch pha loãng;

- Thời gian để cho các hạt to lắng xuống;

- Thời gian khuấy cho phép khi chuẩn bị các dung dịch loãng theo hệ thập phân.

Chú ý - Phải thực hiện các thao tác vô trùng thông thường. Những thao tác quy định trong 8.1 và 8.2 không được tiến hành dưới ánh nắng mặt trời.

8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO : 1989), 8.1.1.

8.2. Dung dịch pha loãng theo hệ thập phân tiếp theo

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), 8.2.

Chú thích 7- Có thể dùng các loạt dung dịch pha loãng khác, thí dụ: dung dịch pha loãng ban đầu của 10 ml mẫu thử trong 90 ml chất pha loãng, hoặc 11 ml mẫu thử trong 99 ml chất pha loãng. Độ tập trung và tính chính xác của phương pháp sẽ lớn hơn khi sử dụng lượng mẫu thử và chất pha loãng lớn hơn.

8.3. Thời gian,tiến hành

Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), 8.3.

8.4. Cấy và nuôi ấm

8.4.1. Lấy hai đĩa Petri (6.3) vô trùng. Dùng pipét vô trùng (6.4) cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử.

8.4.2. Lấy tiếp hai đĩa Petri vô trùng. Dùng một pipét vô trùng khác cho vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch mẫu thử pha loãng 10^-1.

8.4.3. Nếu cần, lặp lại thao tác này, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.

8.4.4. Kiểm tra nhiệt độ của môi trường nuôi cấy (5.5) không được vượt quá 46^oC.

Chú thích 8 - Nếu nhiệt độ của môi trường nuôi cấy lớn hơn 46^oC thì có thể làm hư hại hoặc giết chết các vi sinh vật ưa lạnh trong mẫu thử. Nếu cảm thấy có sự hư hại nào đó thì phải kéo dài việc để đĩa và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thấp.

Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 12 ml đến 15 ml môi trường nuôi cấy (5.5).

Chú thích 9 - Nếu dùng 15 ml mà không thu được sự phân bố đều của các vi sinh vật thì nên dùng 20 ml.

8.4.5. Khuấy trộn thật kỹ chất cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách đặt các đĩa Petri này trên một mặt phẳng nằm ngang, mát.

8.4.6. Thời gian từ khi chuẩn bị dung dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất nuôi cấy với môi trường không được vượt quá 15 phút.

8.4.7. Chuẩn bị đủ số đối chứng để kiểm tra độ vô trùng.

8.4.8. Lật ngược các đĩa đã cấy xong và đặt chúng vào tủ ấm (6.2) ở nhiệt độ 6,5^oC trong 10 ngày.

Chú thích 10 - Để tránh sự lan rộng, cần phải đề phòng như sau:

- Phủ thêm một lớp môi trường nuôi cấy lên mặt các đĩa cấy sau khi đã đông cứng, hoặc

- Nhỏ thêm một giọt glixerol lên trên giấy lọc trong nắp của đĩa.

8.4.9. Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau cũng như xa thành và nóc tủ ấm.

8.5. Đọc kết quả

8.5.1. Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa (xem 9.1), sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.7).

Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu. Điều này rất quan trọng vì những chấm khuẩn lạc nhỏ cũng phải được đếm nhưng điều cơ bản là người kỹ thuật viên phải tránh lẫn lộn các hạt nhỏ không tan hoặc các chất kết tủa trong đĩa với khuẩn lạc nhỏ. Kiểm tra thật cẩn thận các đốm còn nghi ngờ, dùng kính lúp có độ khuếch đại cao hơn nếu thấy cần, để phân biệt được khuẩn lạc với các chất lạ.

8.5.2. Những khuẩn lạc mọc lan được xem là những khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu các khuẩn lạc mọc lan nhưng ít hơn 1/4 bề mặt đĩa thì đếm những khuẩn lạc trên phần còn lại của đĩa và tính số lượng tương ứng cho toàn đĩa. Nếu lan rộng hơn 1/4 bề mặt đĩa thì loại bỏ đĩa đó.

9. Biểu thị kết quả.

9.1. Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất là 10 khuẩn lạc, nhiều nhất là 300 khuẩn lạc. Tính số CFU từ các vi sinh vật, N, trong 1 mililít sữa theo công thức:

N =

Σc        là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại;

n₁         là số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc;

n₂         là số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc;

d          là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.

Chú thích 11 – Nếu có nhiều hơn hai độ pha loãng có thể đếm được cho kết quả từ 10 đến 300 khuẩn lạc thì công thức phải được sửa đổi, có tính đến những độ pha loãng tiếp theo đó. Với ba độ pha loãng thì theo công thức:

N =

Trong đó

n₃         là số đĩa của độ pha loãng thứ ba được giữ lại, có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.

Làm tròn số kết quả thu được đến 2 chữ số có nghĩa. Khi số cần làm tròn là 5 mà không có chữ số có nghĩa nào đứng theo sau thì làm tròn số đứng trước chữ số 5 cho thành số chẵn. Thí dụ:

28.500 làm tròn thành 28.000. và 11.500 được làm tròn thành 12.000.

Lấy kết quả là số đơn vị hình thành khuẩn lạc từ các vi sinh vật ưa lạnh CFU trong 1 mililit sữa, biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10^x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10.

Thí dụ: Việc đếm khuẩn lạc vi sinh vật cho kết quả sau (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng đã được nuôi ủ):

- Độ pha loãng thứ nhất (10^-2) được giữ lại chứa 168 và 215 khuẩn lạc

- Độ pha loãng thứ hai (10^-3) được giữ lại chứa 14 và 25 khuẩn lạc.

N =

- Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên thu được 19 000 hoặc 1,9 x 10⁴ CFU vi sinh vật ưa lạnh trong một mililít sữa.

9.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả là " ít hơn 10 x 1/d CFU vi sinh vật ưa lạnh trong một mililít sữa”, trong đó d là hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp nhất.

9.3. Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 300 khuẩn lạc thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 300 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo “số lượng đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật ưa lạnh ước tính trong một mililít sữa”.

10. Độ lặp lại

Độ chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai lần thử nghiệm riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thí nghiệm, dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được vượt quá 30% của kết quả thấp hơn.

Chú thích

12) Nếu các trường hợp không thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại là 5% hoặc lớn hơn thì cần xem xét nguồn gốc có khả năng gây ra sai lỗi.

13) Định nghĩa về độ lặp lại, xem TCVN 4550:1988 (ISO 5725).

11. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thử nghiệm thu được, chỉ rõ phương pháp biểu thị. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tuỳ ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả. Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.