Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 11202:2016 Thức ăn chăn nuôi-Xác định hàm lượng decoquinat bằng phương pháp sắc ký lỏng

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 11202:2016

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DECOQUINAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG

Animal feeding stuffs - Determination of decoquinate content by liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11202:2016 được xây dựng dựa theo AOAC 2008.08 Decoquinate in Animal Feeds. Liquid Chromatography;

TCVN 11202:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DECOQUINAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG

Animal feeding stuffs - Determination of decoquinate content by liquid chromatographic method

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này cần thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng decoquinat (DEC) trong thức ăn chăn nuôi cho gia súc, gia cầm, thức ăn bổ sung và premix có chứa thuốc thú y.

Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,5 mg/kg.

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.

3  Nguyên tắc

Decoquinat được chiết từ mẫu nghiền vào dung dịch canxi clorua 1 % trong metanol bằng cách dùng máy lắc cơ trong 90 min. Sau khi ly tâm và pha loãng, một phần dung dịch được pha loãng bằng nước, lọc và được phân tích bằng sắc ký lỏng pha đảo với detector huỳnh quang. Các mẫu phát hiện có dương tính dạng vết được khẳng định bằng phân tích sắc ký lỏng dùng bước sóng kích thích thay thế.

4  Thuốc thử

4.1  Nước, loại dùng cho sắc ký lỏng hoặc loại tương đương.

4.2  Metanol, loại dùng cho sắc ký lỏng hoặc loại tương đương.

4.3  Canxi clorua (CaCl₂), ngậm hai phân tử nước, có độ tinh khiết tối thiểu 99 % hoặc loại tương đương.

4.4  Dung môi chiết, canxi clorua 1 % (khối lượng/thể tích) trong metanol

Hòa tan 14,7 g canxi clorua (4.3) trong 1 lít metanol (4.2) và trộn.

4.5  Pha động

Hòa tan 5,0 g canxi clorua (4.3) trong 1 lít hỗn hợp metanol và nước (4.6). Trộn kỹ và lọc chân không, dùng hệ thống lọc dung môi (5.7).

4.6  Hỗn hợp metanol và nước

Trộn 825 ml metanol (4.2) với 175 ml nước (4.1). Trộn kỹ và lọc chân không, dùng hệ thống lọc dung môi (5.7).

4.7  Chất chuẩn decoquinat

Mỗi lô chất chuẩn cần ghi rõ thành phần và độ tinh khiết. Nồng độ của dung dịch chuẩn đối chứng phải được ghi chính xác đến ba chữ số sau dấu phẩy.

4.8  Dung dịch chuẩn gốc, khoảng 300 µg/ml

Cân 30 mg chất chuẩn (4.7), chính xác đến 0,1 mg cho vào bình định mức 100 ml. Hòa tan vào dung dịch canxi clorua 1 % trong metanol (4.4). Sử dụng bể siêu âm để hòa tan, nếu cần và thêm dung dịch này đến vạch và trộn kỹ.

Tính nồng độ của dung dịch chuẩn gốc, C_s, biểu thị theo microgam trên mililit, dựa trên độ tinh khiết của chất chuẩn đối chứng:

Trong đó:

w_s  là khối lượng chất chuẩn, tính bằng gam;

P  là độ tinh khiết của chất chuẩn;

10⁶  là hệ số chuyển từ gam sang microgam;

V_s  là thể tích của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng mililit.

Chuẩn bị dung dịch mới sau 1 tháng và bảo quản trong tủ lạnh.

4.9  Dung dịch thêm chuẩn ở mức vết, khoảng 30 µg/ml

Dùng pipet chuyển 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.8) sang bình định mức 50 ml. Thêm dung dịch canxi clorua 1 % trong metanol (4.4) đến vạch và trộn kỹ. Chuẩn bị dung dịch mới sau 1 tháng và bảo quản trong tủ lạnh.

4.10  Dung dịch chuẩn trung gian, khoảng 30 µg/ml

Dùng pipet chuyển 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.8) sang bình định mức 100 ml. Thêm hỗn hợp metanol và nước (4.6) đến vạch và trộn kỹ. Chuẩn bị dung dịch mới sau 1 tháng và bảo quản trong tủ lạnh.

4.11  Dung dịch chuẩn LC dùng cho phân tích decoquinat trong mẫu ở mức cao

Dùng pipet chuyển một thể tích dung dịch chuẩn trung gian (4.10) hoặc dung dịch chuẩn LC 3a (theo Bảng 1) vào các bình định mức, thêm hỗn hợp metanol và nước (4.6) đến vạch rồi trộn kỹ. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong vòng 1 tháng và bảo quản trong tủ lạnh.

Bảng 1 - Dung dịch chuẩn LC dùng cho phân tích decoquinat có trong mẫu ở mức cao

Chất chuẩn để pha loãng		Chuẩn LC
Dung dịch sử dụng	Thể tích, ml	Thể tích cuối cùng, ml	Nồng độ xấp xỉ, µg/ml	Ký hiệu dung dịch chuẩn
4.10	10,0	50	6,0	dung dịch chuẩn LC 1a
4.10	15,0	100	4,5	dung dịch chuẩn LC 2a
4.10	10,0	100	3,0	dung dịch chuẩn LC 3a
4.10	5,0	100	1,5	dung dịch chuẩn LC 4a
dung dịch chuẩn LC 3a	25,0	100	0,75	dung dịch chuẩn LC 5a

CHÚ THÍCH: Có thể xuất hiện một pic biến dạng nhỏ trong sắc đồ tại phía trước pic decoquinat do đã quá hạn sử dụng, trong các dung dịch mới được chuẩn bị sẽ không có pic này.

4.12  Dung dịch chuẩn LC dùng cho phân tích decoquinat có trong mẫu ở mức vết

Dùng pipet chuyển một thể tích dung dịch chuẩn trung gian (4.10) hoặc dung dịch chuẩn LC 3a (theo Bảng 2) vào các bình định mức, thêm hỗn hợp metanol và nước (4.6) đến vạch rồi trộn kỹ. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong vòng 1 tháng và bảo quản trong tủ lạnh.

Bảng 2 - Dung dịch chuẩn LC dùng cho phân tích decoquinat có trong mẫu ở mức vết

Chất chuẩn để pha loãng		Chuẩn LC
Dung dịch sử dụng	Thể tích, ml	Thể tích cuối cùng, ml	Nồng độ xấp xỉ, µg/ml	Ký hiệu dung dịch chuẩn
4.10	5,0	100	1,5	dung dịch chuẩn LC 4aa
4.10	4,0	100	1,2	dung dịch chuẩn LC 2b
dung dịch chuẩn LC 3a	25,0	100	0,75	dung dịch chuẩn LC 5aa
dung dịch chuẩn LC 3a	15,0	100	0,45	dung dịch chuẩn LC 4b
dung dịch chuẩn LC 3a	3,0	100	0,09	dung dịch chuẩn LC 5b
a Sử dụng cùng dung dịch chuẩn như trong Bảng 1.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Hệ thống sắc ký lỏng

- Hệ thống sắc ký lỏng gồm có các bộ phận sau: bơm không xung, duy trì tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 2,0 ml/min;

- Hệ thống bơm mẫu: bằng tay hoặc tự động, thích hợp để bơm các thể tích 50 µl;

- Detector huỳnh quang, làm việc ở bước sóng kích thích 266 nm và 318 nm, bước sóng phát xạ 394 nm;

- Hệ thống tích phân hoặc hệ thống phân tích dữ liệu;

- Cột phân tích, C18 kích thước 0,46 cm x 25 cm, cỡ hạt 5 µm hoặc loại tương đương, có cột bảo vệ C18.

5.2  Máy lắc.

5.3  Cân phân tích, đối với lượng cân từ 10 g trở lên, có thể đọc được đến 0,1 mg và đối với lượng cân từ 100 g trở lên thì có thể đọc được đến 0,01 g.

5.4  Máy ly tâm, có thể ly tâm các ống 50 ml ở gia tốc 200g.

5.5 Ống ly tâm, bằng polypropylen hoặc vật liệu thích hợp khác, dung tích 50 ml.

5.6  Bình nón, dung tích 250 ml, có nắp đậy bằng thủy tinh.

5.7  Hệ thống lọc dung môi, bằng thủy tinh thích hợp với các bộ lọc đường kính 47 mm và các bộ lọc bằng nylon đường kính 47 mm, cỡ lỗ 0,45 µm.

5.8  Bộ lọc dung dịch thử, có màng lọc nylon cỡ lỗ 0,45 µm.

6  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.

7  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).

Nghiền mẫu phòng thử nghiệm (trên 200 g) sao cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 1 mm, không làm nóng mẫu. Trộn kỹ.

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng

Cần sử dụng mẫu kiểm soát chất lượng và phân tích mẫu kiểm soát này cùng với mỗi mẻ mẫu thử.

Đối với mẫu có thuốc thì dùng mẫu kiểm soát thêm chuẩn ở mức khoảng 30 mg/kg (cho 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.8) vào 10 g mẫu trắng và trộn kỹ). Có thể mẫu kiểm soát dùng cho mẫu có thuốc là 10 g mẫu thức ăn có thuốc chứa hàm lượng decoquinat từ 25 mg/kg đến 50 mg/kg.

Đối với mẫu ở mức vết thì dùng mẫu kiểm soát thêm chuẩn ở mức khoảng 1,5 mg/kg (cho 1,0 ml dung dịch thêm chuẩn ở mức vết (4.9) vào 20 g mẫu trắng và trộn kỹ).

Dùng ống đong chia độ bổ sung 100 ml dung môi chiết (4.4) vào mẫu kiểm soát chất lượng. Đậy nắp và lắc như trong 8.2.

Độ thu hồi đối với mẫu kiểm soát có thuốc và mẫu kiểm soát ở mức vết dự kiến trong khoảng từ 95 % đến 105%.

8.2  Chiết mẫu

Cân chính xác phần mẫu thử của mỗi mẫu vào bình nón 250 ml, đối với mẫu “thuốc" (≥ 10 mg/kg) thì cân 10 g và đối với mẫu mức vết (< 10 mg/kg) thì cân 20 g, ghi lại khối lượng chính xác đến hai chữ số thập phân. Chuyển phần mẫu thử đã cân vào bình nón (5.6). Dùng ống đong chia độ bổ sung 100 ml dung môi chiết (4.4). Đậy nắp bình và lắc 90 min trên máy lắc (5.2). Việc lắc có thể thực hiện vào cuối ngày làm việc và để dịch chiết qua đêm sau đó lắc 5 min.

Chuyển ít nhất 40 ml dịch chiết vào ống ly tâm 50 ml (5.5). Đóng chặt nắp ống và ly tâm 5 min ở gia tốc 200g. (khoảng 1 500 r/min).

Dùng pipet và bình định mức để pha loãng dịch chiết thu được đến khoảng 3 µg/ml bằng dung môi chiết (4.4) theo Bảng 3. Sau đó, dùng pipet chuyển 8,0 ml dịch chiết đề cập ở trên sang bình định mức 10 ml, thêm nước đến vạch và trộn kỹ. Lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.8) (loại bỏ 0,5 ml dịch lọc đầu) cho vào lọ lấy mẫu tự động để chuẩn bị phân tích LC theo 8.3.

Bảng 3 - Dung dịch chiết mẫu dùng để phân tích mẫu có thuốc

Dung dịch pha loãng trong 8.2

Mức đích mg/kg	Lượng dịch chiết ml	Bình định mức ml	Hệ số pha loãng (DF)
< 50	Không	không	1
50 đến 100	5,0	10	2
101 đến 250	5,0	25	5
250 đến 500	5,0	50	10
500 đến 1000	5,0	100	20
1000 đến 2000	5,0	200	40

8.3  Phân tích LC

8.3.1  Điều kiện LC

8.3.1.1  Bước ban đầu

- Rửa xyranh bơm mẫu tự động bằng dung môi, metanol (4.2);

- Cột và cột bảo vệ như trong 5.1;

- Pha động như trong 4.5;

- Tốc độ dòng: 1,1 ml/min;

- Thể tích bơm: 10 µl;

- Thông số detector: bước sóng kích thích 266 nm và bước sóng phát xạ 394 nm;

- Thời gian chạy: 12 min.

8.3.1.2  Bước khẳng định

- Rửa xyranh bơm mẫu tự động bằng dung môi, metanol (4.2);

- Cột và cột bảo vệ như trong 5.1;

- Pha động như trong 4.5;

- Tốc độ dòng: 1,1 ml/min;

- Thể tích bơm: 50µl;

- Thông số detector: bước sóng kích thích 318 nm và bước sóng phát xạ 394 nm;

- Thời gian chạy: 12 min

8.3.2  Độ ổn định của hệ thống

Thời gian lưu cần trong khoảng từ 7 min đến 10 min; hệ số kéo đuôi, T_f phải nhỏ hơn 1,5.

8.3.3  Đường chuẩn

Kiểm tra xác nhận độ tuyến tính của hệ thống LC bằng cách bơm 10 µl của 5 dung dịch chuẩn LC (xem Bảng 1 và Bảng 2) khi bắt đầu và khi kết thức mỗi dãy mẫu, khi thích hợp. Sử dụng diện tích pic trung bình của từng chất chuẩn để dựng đường chuẩn. Dựng đường chuẩn của diện tích pic trung bình theo nồng độ chất chuẩn decoquinat, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml).

Đối với mẫu có thuốc ở mức cao, bơm từng dung dịch chuẩn như trong Bảng 1. Đối với các phép phân tích mẫu ở mức vết, bơm từng dung dịch chuẩn như trong Bảng 2. Hệ số tương quan của phương trình hồi quy phải ≥ 0,999 và đường chuẩn phải đi qua điểm zero ở khoảng tin cậy 95 %. Khoảng tin cậy đối với giao điểm trục y (b) được tính như sau:

Trong đó:

t_n-2  là t student đối với bậc tự do n - 2;

S_b  là sai số chuẩn của giao điểm trục y.

Đối với khoảng tin cậy 95 % giao điểm trục y ước tính với 5 điểm hiệu chuẩn, sử dụng t_n-2 = 3,18.

CHÚ THÍCH: Nếu đường chuẩn của các dung dịch chuẩn trong Bảng 1 và Bảng 2 không tuyến tính và bị cong ở hầu hết các nồng độ thì có thể là bộ nhân quang (PMT) bị quá tải, có thể nên giảm điện áp. Nếu giảm điện áp của PMT không cải thiện được vấn đề thì pha loãng các dung dịch chuẩn và dịch chiết mẫu hai lần bằng hỗn hợp metanol và nước (4.6) trước khi phân tích.

8.4  Phép phân tích

8.4.1  Mẫu có thuốc (≥ 10 mg/kg)

Dùng quy trình 8.3.1.1, bơm ba lần lặp lại 10 µl dung dịch chuẩn LC 3a và kiểm tra để chắc chắn rằng độ lặp lại của diện tích pic nhỏ hơn 2 %. Bơm 10 µl của từng dung dịch chuẩn LC trong Bảng 1. Bơm 10 µl từng dung dịch mẫu thử. Cứ sau 4 hoặc 5 lần bơm dung dịch mẫu thử lại bơm dung dịch chuẩn LC 3a để kiểm tra độ đáp ứng không bị thay đổi đáng kể. Cuối mỗi dãy mẫu, bơm lại 10 µl của 5 dung dịch chuẩn LC nêu trong Bảng 1.

Từ đường chuẩn, xác định hàm lượng chất cần phân tích có trong dung dịch thử, sử dụng diện tích trung bình của từng chất chuẩn để dựng đường chuẩn.

8.4.2  Mẫu ở mức vết (< 10 mg/kg)

Dùng quy trình 8.3.1.1, bơm ba lần lặp lại 10 µl dung dịch chuẩn LC 5a và kiểm tra để chắc chắn rằng độ lặp lại của diện tích pic nhỏ hơn 2 %. Bơm 10 µl của từng dung dịch chuẩn LC trong Bảng 2. Bơm 10 µl của từng dung dịch mẫu thử. Cứ sau 4 hoặc 5 lần bơm dung dịch mẫu thử lại bơm dung dịch chuẩn LC 5a để kiểm tra độ đáp ứng không bị thay đổi đáng kể. Cuối mỗi dãy mẫu, bơm lại 10 µl của 5 dung dịch chuẩn LC nêu trong Bảng 2.

Từ đường chuẩn, xác định hàm lượng chất cần phân tích có trong dung dịch thử, sử dụng diện tích trung bình của từng chất chuẩn để dựng đường chuẩn.

8.4.3  Khẳng định các mẫu dương tính dạng vết nghi ngờ (≥ 0,5 mg/kg)

Dùng quy trình khẳng định 8.3.1.2, bơm ba lần lặp lại 50 µl dung dịch chuẩn LC 5a và kiểm tra để chắc chắn rằng độ lặp lại của diện tích pic nhỏ hơn 2 %. Bơm 50 µl của từng dung dịch chuẩn LC trong Bảng 2. Bơm 50 µl của từng dung dịch mẫu thử dương tính. Cứ sau 4 hoặc 5 lần bơm dung dịch mẫu thử lại bơm dung dịch chuẩn LC 5a để kiểm tra độ lệch. Sự có mặt của decoquinat được khẳng định nếu tỷ lệ diện tích pic phát xạ (266 nm/318 nm) của mẫu thử với diện tích pic phát xạ (266 nm/318 nm) của dung dịch chuẩn LC 5a nằm trong khoảng 5 %.

8.4.4  Tắt hệ thống LC

Khi kết thúc trình tự bơm, rửa hệ thống bằng hỗn hợp metanol và nước (4.6) với tốc độ 1,0 ml/min trong ít nhất 30 min. Đối với các loại bơm được trang bị khóa thổi ngược, tráng pittong bằng nước để loại hết muối còn sót lại.

9  Tính và biểu thị kết quả

9.1  Tính kết quả

Hàm lượng decoquinat có trong mẫu, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:

Trong đó:

A  là diện tích pic decoquinat trong dung dịch thử;

b  là giao điểm của đường chuẩn với trục y;

m  là độ dốc của đường chuẩn;

V  là thể tích của dung dịch chiết (trong trường hợp này là 100 ml + thể tích dung dịch chuẩn bổ sung, nếu có);

w  là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

DF  là hệ số pha loãng.

VÍ DỤ 1: Mẫu có thuốc có A = 2 210 565; b = 2039; m = 568 190; V = 100 ml; w = 10,04 g; DF = 1. Khi đó, hàm lượng decoquinat có trong mẫu, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg);

VÍ DỤ 2: Mẫu ở mức vết: A = 140 680; b = 3 407; m = 570 692; V = 100 ml; w = 20,01 g; DF = 1. Khi đó, hàm lượng decoquinat có trong mẫu, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg):

9.2  Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến ba chữ số sau dấu phẩy đối với mẫu chứa hàm lượng decoquinat bằng hoặc lớn hơn 10 mg/kg và đến hai chữ số có nghĩa đối với mẫu chứa hàm lượng decoquinat nhỏ hơn 10 mg/kg.

Đối với các mẫu dương tính mức vết đã được khẳng định theo 8.4.3, báo cáo kết quả là nhỏ hơn 0,5 mg/kg.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng về xác định decoquinat trong thức ăn chăn nuôi

	Thức ăn cho bê, C	Thức ăn cho bê, D	Thức ăn cho cừu, E	Thức ăn có thuốc, F	Thức ăn cho gà, G	Premix có thuốc, H	Thức ăn cho bê, I	Thức ăn cho lợn, J
Mức đích, mg/kg	49,2	27,4	15,9	97,6	41,0	1260	4,6	2,1
Mức trung bình, mg/kg	49,8	27,4	15,0	99,3	41,4	1310	4,8	2,0
Số lượng phòng thử nghiệm tham gia	11	11	10	10	11	11	13	12
Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ	1	1	2	2	1	1	0	1
Độ lệch chuẩn lặp lại, Sr, mg/kg	0,89	0,35	0,35	1,37	0,69	24,77	0,11	0,11
Độ lệch chuẩn tái lập, SR, mg/kg	1,72	0,91	0,92	2,91	1,47	52,62	0,13	0,11
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	1,78	1,29	2,24	1,38	1,67	1,89	2,23	5,55
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	3,46	3,34	6,14	2,93	3,54	4,01	2,82	5,55
Chỉ số HorRat	0,39	0,34	0,58	0,37	0,39	0,74	0,22	0,38