Tiêu chuẩn TCVN 8741:2011 Bảo quản ngắn hạn vi sinh vật nông nghiệp

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8741:2011

VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP – PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NGẮN HẠN

Agricultural microorganism – Method for short term preservation

Lời nói đầu

TCVN 8741:2011 được chuyển đổi từ 10 TCN 348:99 theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 của Chính phủ qui định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật.

TCVN 8741:2011 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8741:2011

VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP – PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NGẮN HẠN.

Agricultural microorganism – Method for short term preservation

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn giống vi sinh vật nông nghiệp có hoạt tính cố định nitơ, phân giải phốt phát khó tan, phân giải xenluloza, ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn bằng phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng và bảo quản dưới lớp parafin lỏng.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản đư­ợc nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6167:1996, Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phốt phát khó tan.

TCVN 6168:2002, Chế phẩm vi sinh vật phân giải xenlulo.

TCVN 8564:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần cây họ đậu.

TCVN 8565:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật.

TCVN 8566:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn.

3 Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1 Bảo quản vi sinh vật nông nghiệp (preservation of agricultural microorganism)

Bảo quản các giống vi sinh vật nông nghiệp thuần, trong điều kiện phù hợp, bảo đảm không bị tạp nhiễm, tỷ lệ sống không nhỏ hơn 50% và bảo tồn hoạt tính sinh học ban đầu.

3.2 Hoạt tính sinh học của vi sinh vật (bioactivity of agricultural microorganism)

Khả năng của vi sinh vật thông qua hoạt động sống của chúng có tác động đến quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng, kiểm soát sinh học và sinh thái môi trường.

3.3 Vi sinh vật tạp (contaminated microorganism)

Quần thể vi sinh vật không đồng nhất về hình thái tế bào và khuẩn lạc so với giống vi sinh vật ban đầu.

3.4 Tỷ lệ sống của vi sinh vật (survival rate of microorganism)

Tỷ lệ phần trăm giữa lượng tế bào/bào tử tại thời điểm kiểm tra mẫu bảo quản và tại thời điểm bắt đầu bảo quản.

4 Môi trường nuôi cấy và thuốc thử

4.1 Môi trường

Có thể sử dụng môi trường có bán sẵn trên thị trường hoặc một trong các môi trường dưới đây:

4.1.1 Môi trường để nuôi cấy vi khuẩn

- Môi trường YMA (Yeast Mannitol Agar)

Xem Điều A.1 Phụ lục A.

- Môi trường Ashby

Xem Điều A.2 Phụ lục A.

- Môi trường DAC

Xem Điều A.3 Phụ lục A.

- Môi trường Pikovskya

Xem Điều A.4 Phụ lục A.

- Môi trường SPA (Sucrose Peptone Agar)

Xem Điều A.5 Phụ lục A.

4.1.2 Môi trường để nuôi cấy nấm sợi

- Môi trường Czapeck

Xem Điều A.6 Phụ lục A.

- Môi trường Czapeck – Dox

Xem Điều A.7 Phụ lục A.

- Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

Xem Điều A.8 Phụ lục A.

4.1.3 Môi trường để nuôi cấy xạ khuẩn

- Môi trường Gause

Xem Điều A.9 Phụ lục A.

- Môi trường ISP – 4 (Inorganic Salts Starch)

Xem Điều A.10 Phụ lục A.

4.2 Thuốc thử

4.2.1 Parafin lỏng, có tỷ trọng tương đối 0,86-0,89.

4.2.2 Dung dịch pha loãng (dung dịch natri clorua)

Xem Điều A.11 Phụ lục A.

5 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Tủ cấy vô trùng, có vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m³/h, màng lọc ULPA với kích thước lỗ từ 0,1 µm đến 0,3 µm.

5.2 Nồi hấp áp lực, có áp suất tối thiểu 101,3 kPa, nhiệt độ 121 ^oC.

5.3 Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 40 ^oC đến 260 ^oC.

5.4 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 20 ^oC đến 60 ^oC.

5.5 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg.

5.6 Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.

5.7 Máy đo pH, có dải đo pH từ 0 đến 14.

5.8 Máy trộn (Vortex), có tốc độ lắc đạt 1000 r/min, lắc tròn.

5.9 Ống nghiệm, có kích thước 18 mm x 180 mm, 10 mm x 100 mm, có nút nhựa hoặc nút cao su chịu nhiệt

5.10 Bình tam giác, có dung tích 250, 500 ml.

5.11 Ống đong, có dung tích 100, 500, 1000 ml.

5.12 Đĩa Petri, có đường kính 90 mm.

5.13 Que cấy.

5.14 Que gạt mẫu (bàn trang).

5.15 Pipet (Micropipet), có dung tích từ 50 µl đến 200 µl hay 200 µl đến 1000 µl.

6. Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị

6.1.1 Dụng cụ

Các dụng cụ dùng trong nuôi cấy, bảo quản vi sinh vật phải được khử trùng bằng một trong hai cách sau:

- giữ ở nhiệt độ 180 ^oC không ít hơn 1 h trong tủ sấy (5.3) hoặc;

- giữ ở nhiệt độ 121 ^oC không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (5.2).

6.1.2 Môi trường nuôi cấy

Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho (Phụ lục A).

6.1.2.1 Môi trường cho bảo quản

Phân phối các lượng từ 4 ml đến 6 ml môi trường vào các ống nghiệm, đậy nút, khử trùng 30 min ở 121 ^OC trong nồi hấp áp lực (5.2), làm nguội đến 50 ^OC, đặt nghiêng ống nghiệm khoảng 45^O, để yên cho đông đặc, đợi bề mặt thạch khô tiến hành cấy giống.

6.1.2.2 Môi trường cho kiểm tra

Phân phối môi trường vào bình tam giác, đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 ^OC trong nồi hấp áp lực (5.2), làm nguội đến 50 ^OC, phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri đã chuẩn bị sẵn (6.1.1); tiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1).

6.1.3 Parafin lỏng

Parafin lỏng được khử trùng 30 min ở 121 ^OC trong nồi hấp áp lực (5.2), sau đó để ở nhiệt phòng cho bay hết nước lẫn trong dầu.

6.1.4 Dung dịch pha loãng

Cân và hòa tan các thành phần trong nước cất.

Phân phối dung dịch pha loãng vào các ống nghiệm/bình tam giác có dung tích thích hợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml, mỗi bình tam giác chứa 90 ml. Đậy nút và khử trùng ở 121 ^OC không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực.

6.2 Bảo quản trên môi trường thạch nghiêng

6.2.1 Nuôi cấy

Cấy một vòng que cấy giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy thích hợp đã chuẩn bị sẵn (6.1.2.1), tiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1).

Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp (từ 28 ^OC đến 30 ^OC không ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, từ 28 ^OC đến 30 ^OC không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 ^OC đến 37 ^OC không ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn) để vi sinh vật phát triển đồng đều trên vết cấy.

6.2.2 Bảo quản

Bảo quản trong điều kiện nhiệt độ từ 4 ^OC đến 10 ^OC.

Định kỳ sau 1 tháng - 2 tháng bảo quản, kiểm tra lại tỷ lệ sống, độ tạp của vi sinh vật. Nếu tỷ lệ sống của vi sinh vật không lớn hơn 50 % thì phải tiến hành cấy truyền lại. Nếu mẫu vi sinh vật bị tạp nhiễm thì loại bỏ.

6.2.3 Kiểm tra mẫu

6.2.3.1 Tỷ lệ sống của vi sinh vật

a. Chuẩn bị dung dịch huyền phù vi khuẩn

Lấy mẫu bảo quản cần kiểm tra ra khỏi nhiệt độ bảo quản. Khi nhiệt độ của mẫu bảo quản bằng nhiệt độ phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra mẫu. Lấy toàn bộ sinh khối vi sinh vật từ mẫu bảo quản cho vào bình tam giác chứa 90 ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (6.1.4), trộn đều bằng máy lắc hay máy trộn Vortex (5.8). Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu.

Lấy 1 ml dung dịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (6.1.4), tránh chạm đầu côn vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng máy trộn Vortex (5.8) để dung dịch pha loãng mẫu có nồng độ pha loãng là 10^-2. Quá trình này được lặp lại liên tục để dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8.

b. Cấy mẫu

Lấy 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu (6.2.3.1.a) cấy vào đĩa Petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (6.1.2.2). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại trên 3 đĩa petri.

Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch huyền phù thấm đều trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở điều kiện thích hợp (từ 28 ^OC đến 30 ^OC không ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, từ 28 ^OC đến 30 ^OC không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 ^OC đến 37 ^OC không ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn).

c. Tính kết quả

Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu bảo quản trên mỗi đĩa Petri.

Mật độ vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên ml, theo công thức (1).

N =                                                                               (1)

trong đó:

N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng CFU trên ml);

åC là tổng số khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại;

n₁ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.

CHÚ THÍCH 1:

1) Giữ lại các đĩa có chứa không quá 300 khuẩn lạc ở hai độ pha loãng kế tiếp nhau và điều cần thiết là một trong các đĩa này có chứa ít nhất 15 khuẩn lạc;

2) Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa;

3) Biểu thị mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,00 đến 9,99 nhân với 10^x, trong đó x là số mũ của 10.

- Tỷ lệ sống của vi sinh vật được tính theo công thức (2):

R (%) = x 100                                                                                  (2)

trong đó:

R tỷ lệ sống của vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng %);

N₁ là mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm sau bảo quản (được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên ml);

N_o là mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm trước bảo quản (được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên ml).

6.2.3.2 Xác định hoạt tính sinh học của vi sinh vật

Xác định hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật theo TCVN 8564:2010

Xác định hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật theo TCVN 8565:2010 hay TCVN 6167:1996. Trong đó xác định hoạt tính phân giải phốt phát theo TCVN 8565:2010 là phương pháp trọng tài.

Xác định hoạt tính phân giải xenlulo của vi sinh vật theo TCVN 6168:2002

Xác định hoạt tính ức chế nấm gây bệnh cây trồng cạn của vi sinh vật theo TCVN 8566:2010

Xác định hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh cây trồng cạn của vi sinh vật (xem phụ lục B)

6.3 Bảo quản dưới lớp dầu khoáng

6.3.1 Nuôi cấy

Cấy một vòng que cấy giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy thích hợp đã chuẩn bị sẵn (6.1.2.1), tiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1).

- Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp (từ 28 ^OC đến 30 ^OC không ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, từ 28 ^OC đến 30 ^OC không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 ^OC đến 37 ^OC không ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn) để vi sinh vật phát triển đồng đều trên vết cấy.

- Đổ parafin lỏng đã chuẩn bị sẵn (6.1.3) lên bề mặt thạch nghiêng đã cấy giống vi sinh vật sao cho khi dựng đứng ống thạch lên thì bề mặt lớp parafin lỏng cách mép trên của lớp thạch khoảng 1 cm, tiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1).

6.3.2 Bảo quản

Bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 4 ^OC đến 10 ^OC.

Định kỳ sau 3 tháng - 4 tháng bảo quản, kiểm tra tỷ lệ sống, độ tạp của vi sinh vật. Nếu tỷ lệ sống của vi sinh vật không lớn hơn 50 % thì phải tiến hành cấy truyền lại. Nếu mẫu vi sinh vật bị tạp nhiễm thì loại bỏ.

6.3.3 Kiểm tra mẫu

6.3.3.1 Tỷ lệ sống của vi sinh vật (xem 6.2.3.1)

CHÚ THÍCH 3: Cần loại bỏ toàn bộ lớp parafin lỏng trước khi lấy sinh khối vi sinh. Dùng micropipet hút hết lớp parafin lỏng trong ống bảo quản, sau đó dùng giấy lọc thấm khô hết parafin lỏng dính trên bề mặt ống bảo quản.

6.3.3.2 Hoạt tính sinh học của vi sinh vật (xem 6.2.3.2)

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THUỐC THỬ

A.1 Môi trường YMA (Yeast Mannitol Agar)

A.2 Môi trường Ashby

A.3 Môi trường DAC

CHÚ THÍCH A.3: pH môi trường được điều chỉnh bằng KOH

A.4 Môi trường Pikovskaya

A.5 Môi trường SPA (Sucrose Peptone Agar)

A.6 Môi trường Czapek

CHÚ THÍCH A.6: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.7 Môi trường Czapek-Dox

CHÚ THÍCH A.7: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.8 Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

CHÚ THÍCH A.8:

- khoai tây thái nhỏ, cho vào 1 l nước và đun sôi trong 20 min,

- sau đó lọc lấy nước trong để sử dụng làm môi trường.

A.9 Môi trường Gauze

CHÚ THÍCH A.9: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.10 Môi trường ISP- 4 (Inorganic Salts Starch)

CHÚ THÍCH A.10: pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl hoặc NaOH.

A.11 Dung dịch pha loãng (dung dịch natri clorua)

PHỤ LỤC B

(Qui định)

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH CÂY TRỒNG CẠN

B.1 Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua kích thước vòng đối kháng

B.1.1 Cách tiến hành

Lấy 0,1 ml dung dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ tế bào vi sinh vật đạt 10⁸ CFU/ml) cấy vào đĩa Petri chứa 30 ml môi trường SPA (lớp thạch thứ nhất) đã chuẩn bị sẵn (6.1.2.2).

Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch vi khuẩn gây bệnh thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch;

Sau khi bề mặt thạch khô (khoảng 4 h), tiếp tục phủ khoảng 15 ml đến 20 ml môi trường thích hợp với vi sinh vật đối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ nhất. Các đĩa thạch được để khô trong 45 min;

CHÚ THÍCH 2: Nhiệt độ của môi trường khi phủ lên trên lớp thạch thứ nhất từ 35 ^OC đến 45 ^OC. Độ dày của lớp thạch thứ hai từ 2 mm đến 3 mm.

Lấy 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu (xem 6.2.3.1.a) cấy lên bề mặt lớp thạch thứ hai. Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch mẫu thấm hoàn toàn trên bề mặt lớp thạch thứ hai;

Các đĩa thạch được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ từ 28 ^OC đến 32 ^OC trong thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày;

Mỗi mẫu được lặp lại không ít hơn 3 lần.

B.1.2 Tính kết quả

Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật thể hiện thông qua kích thước vòng đối kháng (vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc), tính bằng mm theo công thức (3):

Kích thước vòng đối kháng = D - d                                                        (3)

trong đó

D là đường kính vòng đối kháng, tính bằng mm;

D là đường kính khuẩn lạc, tính bằng mm.

Kết quả là giá trị trung bình cộng của các lần lặp lại.

B.2 Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua tỷ lệ cây bị bệnh

B.2.1 Tiến hành thử nghiệm

Thử nghiệm được tiến hành với 2 công thức: Công thức đối chứng (nhiễm vi khuẩn gây bệnh), công thức thí nghiệm (nhiễm vi sinh vật đối kháng và vi khuẩn gây bệnh). Mỗi công thức được lặp lại không ít hơn 3 lần với tổng số cây không ít hơn 50 cây;

Dung dịch vi sinh vật đối kháng được bón vào đất vô trùng trước khi gieo trồng, đảm bảo mật độ vi sinh vật đối kháng đạt 10⁶ CFU/g đất;

Ngâm hạt hoặc củ giống trong dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ đạt 10⁸ CFU/ml) trong thời gian 30 min. Gieo (trồng) hạt (hoặc củ) đã nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào đất đối với công thức đối chứng và đất đã được nhiễm dịch vi sinh vật đối kháng đối với công thức thí nghiệm;

Thí nghiệm được chăm sóc theo qui trình phù hợp với từng đối tượng cây chủ; đảm bảo sự phát triển, phát sinh của vi khuẩn gây bệnh; Sử dụng nước vô trùng để giữ ẩm độ tương đối (RH) không nhỏ hơn 70 % và nhiệt độ đạt từ 25 ^oC đến 30 ^oC;

Trong thời gian từ 30 đến 45 ngày kể từ khi gieo trồng, phải quan sát và ghi nhận hàng ngày tình trạng sức khỏe của cây trồng (không có triệu chứng bệnh hoặc có triệu chứng bệnh).

CHÚ THÍCH 4:

1) Đất được khử trùng bằng phương pháp khử trùng ngưng đoạn [khử trùng 3 ngày liên tiếp ở 121 ^OC không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (5.2)].

2)Hạt, củ giống được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch H₂O₂ 4 %, thời gian từ 3 min đến 4 min, sau đó rửa sạch 2 - 3 lần bằng nước vô trùng.

3) Thử nghiệm phải bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưởng của các yếu tố phi thí nghiệm.

B.2.2 Tính kết quả

Tỷ lệ cây bị bệnh (%) được tính theo công thức (4):

So sánh tỷ lệ cây bị bệnh giữa công thức thí nghiệm với công thức đối chứng và đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật theo các cấp độ nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Mức độ hoạt tính đối kháng của vi sinh vật