Tiêu chuẩn TCVN 13519:2022 Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng selen

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13519:2022

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SELEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG

Animal feeding stuffs - Determination of selenium content by fluorometric method

Lời nói đầu

TCVN 13519:2022 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 996.16 Selenium in Feeds and Premixes;

TCVN 13519:2022 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SELEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG

Animal feeding stuffs - Determination of selenium content by fluorometric method

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này cần thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng selen (Se) trong thức ăn chăn nuôi và premix bằng phương pháp đo huỳnh quang.

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 6498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.

3  Nguyên tắc

Tất cả các dạng của selen được chuyển về dạng vô cơ như Se⁴⁺ hoặc Se⁶⁺ bằng phân hủy oxi hóa. Axit percloric trong hỗn hợp oxi hóa ngăn ngừa thất thoát selen. Selen phải ở dạng Se⁴⁺ để phản ứng với 2,3-diaminonaphthalen. Tất cả các dạng selen trong trong hỗn hợp phân hủy được chuyển thành Se⁴⁺ do việc khử bằng axit clohydric. Quy trình khử phân hủy phù hợp để định lượng selen bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử tạo hydrua liên tục (HGAA). Các nền mẫu có chứa lượng lớn sắt hòa tan (≥ 1 mg sắt/lượng phân tích) có thể gây khó khăn cho quy trình đo huỳnh quang, nhưng điều này thường được phát hiện khi xuất hiện kết tủa đen trong quy trình tạo dẫn xuất và được xử lý bằng cách pha loãng hoặc tăng lượng thuốc thử chelat hóa (EDTA).

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng là nước đã loại ion được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh để chuẩn bị các dung dịch và để pha loãng.

4.1  Xyclohexan (C₆H₁₂).

4.2  Axit clohydric (HCl) đặc.

4.3  Dung dịch axit clohydric (HCl), 0,1 M

Dùng pipet lấy 8,3 ml axit clohydric đặc (4.2) cho vào bình định mức 1 L và pha loãng bằng nước từ từ đến vạch.

4.4  Axit nitric (HNO₃), 70 %.

4.5  Axitpercloric (HClO₄), 70 %.

4.6  Thuốc thử 2,3-Diaminonaphthalene (DAN)

Cân 1,0 g thuốc thử DAN dạng bột (độ tinh khiết 97 %) và chuyển vào bình nón dung tích 2 L, thêm 500 ml dung dịch axit clohydric 0,1 M (4.3) và làm ấm bình 15 min trong nồi cách thủy ở 60 °C. Khuấy để hòa tan DAN dạng bột. Thêm axit clohydric 0,1 M (4.3) vào bình đến vạch 1 L. Cho khoảng từ 40 ml đến 50 ml xyclohexan (4.1) để chiết trong khoảng thời gian từ 3 min đến 5 min, loại bỏ lớp xyclohexan. Lặp lại việc chiết này ba lần. Lọc thuốc thử DAN qua giấy lọc đã được làm ướt trước bằng axit clohydric 0,1 M (4.3). Thuốc thử DAN khi được bảo quản trong tủ lạnh và tránh ánh sáng thì có thể bền ít nhất 2 tuần.

4.7  Dung dịch chuẩn axit (Ethylenedinitrilo) tetraacetic (EDTA)

4.7.1  Dung dịch chuẩn gốc EDTA, 0,1 M

Cho 37,2 g muối dinatri của axit (ethylenedinitrilo)tetraacetic vào bình định mức 1 L và pha loãng bằng nước đến vạch.

4.7.2  Dung dịch chuẩn làm việc EDTA, 0,01 M

Tùy thuộc vào số lượng ống cần phân tích, pha loãng dung dịch gốc chuẩn EDTA bằng nước (1 + 9) đủ để phân phối 15 ml/ống (ví dụ: 600 ml cho 40 ống).

4.8  Dung dịch chuẩn selenit

4.8.1  Dung dịch chuẩn gốc selenit, 0,4 μg/ml

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch chuẩn selenit (1 000 μg/ml trong dung dịch axit nitric 1 %) vào bình định mức 1 L và pha loãng đến vạch bằng dung dịch axit clohydric 0,1 M (4.3). Dùng pipet chuyển 40 ml dung dịch selenit đã được pha loãng này vào bình định mức 100 ml và thêm dung dịch axit clohydric 0,1 M (4.3) đến vạch để tạo thành dung dịch chuẩn gốc selenit 0,4 μg/ml.

CHÚ THÍCH: Cách khác, hòa tan 0,400 g selen trong axit nitric trong bình định mức 1 L và pha loãng đến vạch bằng dung dịch axit clohydric 0,1 M (4.3). Dùng pipet chuyển 10,0 ml dung dịch selen đã được pha loãng vào bình định 1 L mức và thêm dung dịch axit clohydric 0,1 M (4.3) đến vạch. Để tạo thành dung dịch chuẩn gốc selenit 0,4 μg/ml tiếp tục pha loãng 10 ml dung dịch selen nêu trên trong 100 ml dung dịch axit clohydric 0,1 M (4.3).

4.8.2  Dung dịch hiệu chuẩn selenit

Dùng pipet lấy 0 ml (mẫu trắng thuốc thử), 0,2 ml, 0,5 ml, 1 ml và 1,5 ml dung dịch chuẩn gốc selenit (4.8.1) vào các ống riêng rẽ để thu được các hàm lượng selen tương ứng trong mỗi ống: 0 μg, 0,08 μg, 0,2 μg, 0,4 μg và 0,6 μg để dựng đường chuẩn. Dùng pipet lấy 0,5 mL dung dịch chuẩn selenat (4.9) cho vào ống (0,2 μg/ống) để kiểm tra hiệu quả của giai đoạn khử do selenat không phản ứng với DAN.

4.9  Dung dịch chuẩn natri selenat, 0,4 μg Se/ml

Chuyển 0,1915 g Na₂SeO₄ khan vào bình định mức 1 L, pha loãng bằng nước đến vạch. Trộn đều.

Dùng pipet lấy 5,00 ml dung dịch Na₂SeO₄ cho vào bình định mức 1 L và pha loãng bằng nước đến vạch.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Bình định mức, dung tích 100 ml và 1 000 ml.

5.2  Pipet, có dung tích thích hợp.

5.3  Nồi cách thủy, duy trì được nhiệt độ 60 °C ± 2 °C và duy trì được nhiệt độ sôi của nước.

5.4  Máy lắc vortex.

5.5  Bình nón, dung tích 250 ml, 1 000 ml và 2 000 ml.

5.6  Giấy lọc, kích thước lỗ 11 μm.

5.7  Tủ hút, thích hợp để xử lý axit percloric.

5.8  Máy đo huỳnh quang, bước sóng kích thích 375 nm và bước sóng phát xạ 525 nm.

5.9  Hệ thống phân hủy mẫu, ví dụ hệ thống microKjeldahl

5.10  Bình phân hủy, để sử dụng cùng với hệ thống phân hủy.

5.11  Bộ chiết quay, duy trì được tốc độ 60 r/min đến 70 r/min, kèm theo khay đựng ống nghiệm để trộn.

5.12  Bi thủy tinh.

5.13  Bếp điện.

6  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 13052:2021^[1].

7  Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).

8  Cách tiến hành

8.1  Phân hủy sơ bộ

Cân khoảng 10 g mẫu thử (Ws), chính xác đến 10 mg, cho vào bình nón 1 000 ml (5.5). Thêm từ từ 75 ml axit nitric (HNO₃) (4.4) và vài viên bi thủy tinh (5.12) vào bình.

CHÚ Ý: Các mẫu có chứa một lượng lớn đá vôi hoặc các vật liệu dễ bị oxy hóa có thể gây ra bọt khi thêm axit nitric.

Đun nóng mẫu đã chuẩn bị bằng bếp điện (5.13) cho đến khi mẫu ngập trong dung dịch và axit nitric bốc khói (thường 15 min là đủ).

Làm nguội dung dịch và pha loãng bằng nước sao cho hàm lượng selen trong khoảng từ 0,04 μg/ml đến 0,60 μg/ml. Ghi lại thể tích cuối cùng (V_t) của dung dịch sau pha loãng bằng mililit.

8.2  Phân hủy

CHÚ THÍCH: Nếu không có sẵn hệ thống phân hủy để thực hiện các quy trình khử và phân hủy, sử dụng quy trình thay thế trong 8.5.

Trộn kỹ dung dịch phân hủy sơ bộ (8.1) để hòa tất cả các chất chưa tan còn lại, dùng pipet lấy các lượng 1,00 ml dung dịch cho vào các ống nghiệm (bình phân hủy). Nếu hàm lượng selen của dung dịch dự đoán thấp (< 0,02 μg/ml), thì có thể sử dụng đến 10 ml. Ghi lại thể tích (V_a) chính xác đến 0,01 ml.

Thêm 2 đến 3 viên bi thủy tinh (5.12) vào mỗi ống nghiệm gồm cả ống mẫu trắng, dung dịch hiệu chuẩn selenit và dung dịch chuẩn Na₂SeO₄.

Thêm 4 ml axit nitric (4.4), 1 ml axit percloric (4.5) hoặc thêm 5 ml hỗn hợp axit percloric- axit nitric (1 + 4 phần thể tích) vào mỗi ống.

Đặt ống nghiệm trong khối gia nhiệt nhôm. Tăng nhiệt độ từ từ lên 210 °C (khoảng 2 h). Khói trắng của phản ứng axit percloric sẽ xuất hiện trong các ống nghiệm sau khi quá trình phân hủy hoàn tất. Sau khi đạt trạng thái khói trắng, gia nhiệt thêm 15 min.

Lấy ống nghiệm ra khỏi khối gia nhiệt. Làm mát các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng và làm nóng khối gia nhiệt đến khoảng từ 110 °C đến 150 °C.

8.3  Khử

Cho 0,5 ml axit clohydric đặc (4.2) vào các ống nghiệm (8.2). Đặt ống nghiệm này vào lại khối gia nhiệt và làm nóng trong 30 min. Đảm bảo nhiệt độ của khối gia nhiệt luôn được duy trì trong khoảng 110 °C đến 150 °C.

8.4  Tạo dẫn xuất và định lượng

Lấy các ống nghiệm ra khỏi khối gia nhiệt và để nguội đến nhiệt độ phòng.

Thêm 15 ml dung dịch chuẩn làm việc EDTA (4.7.2) và 2 ml thuốc thử DAN (4.6) vào ống nghiệm.

CHÚ THÍCH 1: Cả hai dung dịch có thể được thêm đồng thời, tuy nhiên, không nên trộn lẫn hai dung dịch này quá 10 min trước khi sử dụng. (Ví dụ, nếu không sẽ hình thành kết tủa).

Trộn kỹ từng ống trên máy trộn Vortex (5.4), trộn xuống đáy ống ít nhất hai lần.

Đặt giá đựng các ống nghiệm vào nồi cách thủy ở 60 °C và duy trì 30 min. Đảm bảo rằng mức nước cao hơn mức của hỗn hợp phản ứng.

Lấy giá đựng ống nghiệm ra khỏi nồi cách thủy và làm mát ống nghiệm 5 min dưới vòi nước chảy.

Thêm 5 ml xyclohexan (4.1) vào mỗi ống, đậy nắp ống và chiết từ 5 min đến 10 min trong bộ chiết quay (5.11) với tốc độ 60 đến 70 rpm.

CHÚ THÍCH 2: Việc chiết có thể được thực hiện thủ công bằng cách lắc (đảo ngược) giá đỡ ống để có thể chiết tối đa.

Chuyển lớp xyclohexan vào cuvet của máy đo huỳnh quang. Đảm bảo rằng dung dịch không còn giọt nước nào bám vào thành cuvet trong đường quang.

Cài đặt bước sóng kích thích của máy đo huỳnh quang ở 375 nm và bước sóng phát xạ ở 525 nm. Cài đặt điểm không của máy đo huỳnh quang với xyclohexan và đọc giá trị số đo huỳnh quang của mẫu trắng để đánh giá chất lượng thuốc thử DAN. Nếu số đọc lớn hơn 2 đến 3 đơn vị huỳnh quang, thì thuốc thử DAN phải được chiết lại bằng xyclohexan. Một lần nữa cài đặt điểm của máy đo huỳnh quang so với mẫu trắng.

Xác định huỳnh quang (F) của các dung dịch hiệu chuẩn selenit và tính phương trình hồi quy đối với đường chuẩn, sử dụng độ dốc (k) để tính nồng độ selen trong các dung dịch thử. Tùy thuộc vào thiết bị có sẵn, điều này có thể được thực hiện tự động bằng quy trình hiệu chuẩn tích hợp.

CHÚ THÍCH 3: Đáp ứng huỳnh quang là tuyến tính khi sử dụng các dung dịch hiệu chuẩn selenit ở nồng độ nêu trên. Các chất chuẩn có chứa hàm lượng cao đến 2 μg/lọ thì có thể duy trì được mối quan hệ tuyến tính.

Xác định huỳnh quang của dung dịch thử.

8.5  Quy trình khử và phân hủy thay thế

Khi không có sẵn hệ thống phân hủy mẫu, thì tiến hành khử và phân hủy trong bình microKjeldahl như sau:

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch phân hủy sơ bộ (8.2) vào bình microKjeldahl 30 ml. Nếu hàm lượng selen dự kiến thấp (< 0,02 μg/ml), có thể sử dụng đến 10 ml. Ghi lại thể tích (V_a) chính xác đến 0,01 ml.

Thêm vài viên bi thủy tinh (5.12) vào mỗi bình. Thêm 4 ml axit nitric (4,4) và 1 ml axit percloric (4.5) vào mỗi bình hoặc thêm vào mỗi bình 5 ml hỗn hợp axit percloric- axit nitric (1 + 4 phần thể tích), bao gồm cả mẫu trắng, dung dịch hiệu chuẩn selenit và dung dịch chuẩn Na₂SeO₄.

Đặt các bình lên giá đỡ microKjeldahl với ống thu khói được nối với hệ thống hút khí sao cho thu được hầu hết khói từ bình.

CHÚ THÍCH: Có thể bỏ qua hệ thống hút nêu trên nếu có sẵn hệ thống hút axit perchloric.

Điều chỉnh bộ gia nhiệt để làm sôi nhẹ lượng chứa trong bình.

Gia nhiệt các bình cho đến khi axit nitric bay hơi và khói trắng của axit percloric có thể nhìn thấy rõ ở cổ bình. Gia nhiệt bình 15 min sau khi quan sát thấy khói trắng của axit percloric.

Lấy bình ra khỏi giá đỡ của bộ phân hủy, để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm 0,5 ml axit clohydric đặc (4.2).

Đặt bình trong nồi cách thủy đun sôi (5.3) và duy trì 30 min. Lấy bình ra khỏi nồi cách thủy và để nguội đến nhiệt độ phòng.

Chuyển hết lượng chứa trong bình sang ống nghiệm có nắp được lót bằng Teflon sử dụng 15 ml dung dịch chuẩn làm việc EDTA (4.7.2). Thêm 2 ml thuốc thử DAN (4.6).

Tiến hành tiếp theo 8.4.

9  Tính kết quả

Tùy thuộc vào phần mềm hỗ trợ của máy đo huỳnh quang, dữ liệu hiệu chuẩn, hệ số pha loãng và khối lượng mẫu thử có thể tính được hàm lượng cuối cùng của selen, báo cáo kết quả về hàm lượng selen bằng microgam trên gam đến ba chữ số sau dấu phẩy.

Khi không có sẵn phần tính tự động, thì tính hàm lượng selen có trong mẫu theo Công thức (1) sau:

Trong đó:

F là số đọc huỳnh quang;

k là độ dốc của đường hồi quy thu được từ việc vẽ đồ thị Se (trục x) so với đọc huỳnh quang (trục y) (k = y / x);

W_s là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V_t là tổng thể tích dung dịch pha loãng, tính bằng mililit (ml);

V_a là lượng dung dịch đã phân hủy sơ bộ được sử dụng trong phân tích, tính bằng mililit (ml).

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm để xác định selen trong thức ăn chăn nuôi và premix

Bảng A.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng để xác định selen trong thức ăn chăn nuôi và premix bằng phương pháp huỳnh quang^a

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 13052:2021 Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.

[2] AOAC 996.16 Selenium in Feeds and Premixes