Tiêu chuẩn TCVN 14331:2025 Phân bón - Xác định myo-inositol bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14331:2025

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH MYO-INOSITOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS)

Fertilizers - Determination of myo-inositol by gas chromatography - mass spectroscopy (GC-MS)

Lời nói đầu

TCVN 14331:2025 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH MYO-INOSITOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS)

Fertilizers - Determination of myo-inositol by gas chromatography - mass spectroscopy (GC-MS)

CẢNH BÁO: Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định myo-inositol trong phân bón có hàm lượng lớn hơn 100 mg/kg bằng sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS).

Thông tin giới thiệu hoạt chất myo-inositol xem Phụ lục A.

2 Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử;

TCVN 9486:2018, Phân bón - Lấy mẫu;

TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991), Phân bón rắn - phương pháp chuẩn bị mẫu để xác định các chỉ tiêu hóa học và vật lý;

TCVN 12105:2018, Phân bón vi sinh vật - Lấy mẫu.

3 Nguyên tắc

Hợp chất myo - inositol trong phân bón được chiết bằng nước cất, sau đó được làm sạch, khô bằng khí nitơ. Cặn thu được phản ứng với anhydric axetic ở 80 °C và hòa tan bằng HCI 10 %. Tiếp tục chiết bằng dung môi hexan và được xác định trên máy sắc kí khối phổ (GC/MS).

4 Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các hóa chất, thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích dùng cho GC và nước cất hai lần phù hợp với TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 μS/m); sau đây gọi là nước).

4.1  Nước khử ion (DI).

4.2  Etanol (C₂H₅OH) ≥ 98 % dùng cho sắc kí.

4.3  Hexan (C₆H₁₄) dùng cho sắc kí.

4.4  Axit clohydric (HCI) đậm đặc (d = 1,184.)

4.5  Anhydric axetic (C₄H₆O₃) ≥ 98 % dùng cho sắc kí.

4.6  Pyridin (C₅H₅N) dùng cho sắc kí.

4.7  Hydroxylammonium chloride (CIH₄NO) tinh thể.

4.8  Kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân từ nước, (K4[Fe(CN)₆].3H₂O) tinh thể.

4.9  Kẽm sulfat ngậm bảy phân từ nước, (ZnSO₄.7H₂O) tinh thể.

4.10  Dung dịch hỗn hợp etanol : nước (tỷ lệ 1:1 v/v)

Lấy một thể tích etanol (4.2) pha cùng với một thể tích nước đã khử ion (4.1).

4.11  Dung dịch axit clohydric 10 %

Hút 22,6 mL axit clohydric đậm đặc (4.4) hòa tan với khoảng 60 mL nước trong bình định mức dung tích 100 mL. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

4.12  Dung dịch Pyridin/ Hydroxylammonium chloride 2,5 %

Hòa tan 2,5 g hydroxylammonium chloride (4.7) trong trong bình định mức dung tích 100 mL có chứa sẵn pyridin (4.6). Thêm pyridin (4.6) đến vạch định mức và lắc đều.

4.13  Thuốc thử Carrez, được chuẩn bị như sau:

4.13.1  Thuốc thử Carrez I: Dung dịch kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước, c(K4[Fe(CN)₆].3H₂O) = 150 g/L.

Hòa tan 15,0 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (4.8) trong trong bình định mức dung tích 100 mL có sẵn khoảng 50 mL nước. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

4.13.2  Thuốc thử Carrez II: Dung dịch kẽm sulfat ngậm bảy phân tử nước, c(ZnSO₄.7H₂O) = 300 g/L

Hòa tan 30,0 g kẽm sulfat ngậm bảy phân tử nước (4.9) trong bình định mức dung tích 100 mL có sẵn khoảng 50 mL nước. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

4.14  Myo-inositol (C₆H₁₂O₆), dạng rắn với độ tinh khiết tối thiểu 98 %.

4.15 Dung dịch chuẩn gốc myo-inositol, nồng độ khoảng 2000 mg/L

Cân chính xác khoảng 0,100 g myo-inositol (4.14), chuyển định lượng sang bình định mức dung tích 50 mL. Pha loãng bằng nước DI (4.1) đến vạch. Trộn kỹ. Bảo quản trong tủ lạnh.

4.16  Dung dịch chuẩn trung gian myo-inositol, khoảng 200 mg/L

Pha loãng 5,0 mL dung dịch chuẩn gốc myo-inositol (4.15) bằng nước DI (4.1) trong bình định mức dung tích 50 mL và trộn kỹ. Loại bỏ dung dịch sau khi sử dụng.

4.17  Dung dịch chuẩn trung gian myo-inositol, khoảng 10 mg/L

Pha loãng 2,5 mL dung dịch chuẩn trung gian myo-inositol (4.16) bằng nước DI (4.1) trong bình định mức dung tích 50 mL và trộn kỹ. Loại bỏ dung dịch sau khi sử dụng.

4.18  Dung dịch chuẩn làm việc myo-inositol, nồng độ 0,05 -1,0 mg/L

Pha dãy dung dịch chuẩn làm việc myo-inositol trong dung dịch hỗn hợp etanol : nước (tỷ lệ 1:1 v/v) (4.10). Sử dụng sáu bình định mức dung tích 10 mL, cho vào mỗi bình thứ tự số mililit dung dịch chuẩn trung gian myo-inositol 10 mg/mL (4.17) và dung dịch hỗn hợp etanol : nước (tỷ lệ 1:1 v/v) (4.10) vừa đủ 10 mL, thu được dãy dung dịch chuẩn làm việc myo-inositol (xem Bảng 1).

Bảng 1 - Dãy dung dịch chuẩn làm việc myo-inositol nồng độ từ 0,05 mg/L đến 0,5 mg/L

CHÚ THÍCH:

- Dung dịch chuẩn được sử dụng trong ngày

- Tùy thuộc vào điều kiện trang thiết bị và hàm lượng myo-inositol trong mẫu thử để dựng đường chuẩn sao cho phù hợp.

5 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,001 g.

5.2  Máy ly tâm, gia tốc 5000 vòng/min, dung tích ống 50 mL.

5.3  Bể siêu âm.

5.4  Thiết bị GC/MS được trang bị như sau:

+ Cột mao quản HP - 5 MS, có chiều dài 30m, đường kính trong 0,25 mm, chiều dày pha tĩnh 0,5 μL hoặc tương đương;

+ Bộ bơm mẫu chia dòng và không chia dòng;

+ Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay;

+ Hệ thống máy vi tính.

5.5  Pipet, dung tích 1,0; 2,0; 5,0 mL có vạch chia đến 0,1 mL.

5.6  Giấy lọc, giấy lọc Whatman 0,45 pm hoặc tương đương.

5.7 Bình định mức, dung tích 10; 50; 100 mL.

5.8  Micropipet, dung tích 0,1 mL - 1 mL.

5.9  Màng lọc, kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

6 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Đối với mẫu phân bón bình thường, lấy mẫu theo TCVN 9486:2018. Đối với mẫu phân bón vi sinh, lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.

6.2  Chuẩn bị mẫu

Các mẫu đã chuẩn bị được bảo quản ổn định ở nhiệt độ từ 1 °C đến 8 °C trong các vật chứa kín có thể bền đến 5 ngày. Sau 5 ngày các mẫu phải được chuẩn bị lại. Trộn kỹ các mẫu lỏng để đảm bảo độ đồng nhất.

6.2.1  Phân bón dạng rắn: Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991).

6.2.2  Phân bón dạng lỏng, huyền phù

6.2.2.1  Dạng lỏng: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

6.2.2.2  Dạng huyền phù: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7 Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu

7.1.1  Dùng cân phân tích (5.1), cân khoảng 1 đến 2 g mẫu thử (chính xác đến 0,001 g) đã được chuẩn bị (6.2.1 và 6.2.2.2). Đối với mẫu dạng lỏng (6.2.2.1), dùng pipet (5.5) hút khoảng 1- 2mL mẫu và cân chính xác để xác định khối lượng cho vào ống ly tâm dung tích 50 mL (5.2).

7.1.2 Dùng pipet (5.5), thêm chính xác 20 mL nước, lắc đều và đưa vào bể siêu âm (5.3) hỗn hợp trên trong 20 min ở nhiệt độ thường.

7.1.3 Thêm 0,2 mL thuốc thử Carrez (4.13) mỗi loại, lắc nhẹ sau đó ly tâm 5000 vòng/min trong 3 min. Lọc dịch mẫu qua giấy lọc (5.6), sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm (5.9) (dung dịch A).

7.1.4  Hút 0,2 mL dung dịch A vào ống có dung tích 10mL, thổi khô dung dịch với khí Nitơ ở 70 - 80 °C.

7.1.5  Thêm chính xác 0,35 mL dung dịch pyridine/hydroxylammonium chloride 2,5 % (4.12), lắc đều, đun nóng trong 30 min ở 70 - 75 °C.

7.1.6  Thêm tiếp 0,6 mL anhydric axetic (4.5) lắc đều, đưa vào bề điều nhiệt để phản ứng ở 80 °C trong 45 min.

7.1.7 Để nguội, thêm tiếp 1,5 mL axit HCI 10% (4.11), 1mL hexan (4.3), lắc đều, lấy lớp hữu cơ phía trên để định lượng bằng GC/MS.

7.2  Điều kiện phân tích

Cột HP-5MS kích thước 30mm × 0,25mm, đường kính 0,5 μm;

Chương trình nhiệt : 150 °C - ( 10 °C/min) 280 °C - (100 °C/ min) à 320°C;

Thời gian cân bằng nhiệt độ lò cột: 2 min;

Nhiệt độ đầu cột : 300 °C;

Tốc độ dòng khí Heli: 1 mL/ min;

Chế độ bơm : Không chia dòng (tốc độ sục khí 50 mL/ min);

Chế độ phân tích: SIM (Hoặc Full scan);

Chế độ ion hóa : El;

Nhiệt độ đường truyền: 280°C;

Chế độ ghi tín hiệu SIM với 4 m/z;

Mảnh định lượng: m/z = 168;

Mảnh định tính: m/z = 210, 126, 115.

7.3  Xác định Myo- inositol bằng thiết bị GC/MS

Sau khi hệ thống GC/MS ổn định, dùng bơm 1 dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất trong dãy dung dịch chuẩn làm việc (4.18) cho đến khi số đo diện tích của pic chuẩn thay đổi không lớn hơn 5 %. Sau đó bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (4.18) nồng độ từ thấp đến cao (Bảng 1) qua cột tách, dựng đường chuẩn hàm lượng hoạt chất myo-inositol tương ứng với diện tích pic thu được.

Bơm dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần. Xác định hàm lượng hoạt chất myo-inositol dựa theo đường chuẩn đã được xây dựng. Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử bằng dung dịch hỗn hợp etanol : nước (tỷ lệ 1:1 v/v) (4.10).

8 Tính kết quả

Hàm lượng hoạt chất Myo- inositol (X) trong mẫu phân bón, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), theo công thức:

trong đó:

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song. Nếu sai lệch giữa các lần thử lớn hơn 5% giá trị tương đối thì phải tiến hành làm lại.

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm cần có đầy đủ những thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm;

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Ngày thử nghiệm;

f) Kết quả thử nghiệm lấy chữ số có nghĩa sau dấu phẩy phù hợp với TCVN 9595-3:2013.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin về hoạt chất myo-inositol

- Công thức cấu tạo

- Tên hoạt chất: myo-inositol

- Tên hóa học: (1 R,2S,3r,4R,5S,6s)-cyclohexane-1,2,3,4,5,6-hexol

- Công thức phân tử: C₆H₁₂O₆

- Khối lượng phân tử: 180,16 gam

- Nhiệt độ sôi: 225 - 227 °C

- Độ hòa tan: tan trong nước, không tan trong rượu và ete

- Dạng bề ngoài: chất rắn, màu trắng

Phụ lục B

(Tham khảo)

Thông tin về sắc kí đồ điển hình của hoạt chất myo-inositol

Sắc ký đồ điển hình của hoạt chất myo-inositol trong phân bón

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Determination of Mannitol Sorbitol and Myo-lnositol in Olive Tree Roots and Rhizospheric Soil by Gas Chromatography and Effect of Severe Drought Conditions on Their Profiles; Journal of Chromatographic Science, Volume 53, Issue 10, November/December 2015, Pages 1631-1638, https://doi.org/10.1093/chromsci/bmv066

[2] Gas chromatographic-mass spectrometric characterisation of tri- and tetrasaccharides in honey ; Food Chemistry Volume 120, Issue 2, 15 May 2010, Pages 637-642.