Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13875:2023 Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13875:2023

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG NHANH ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA COMPACT DRY EC

Microbiology of the food chain - Rapid enumeration of Escherichia coli and conforms by the method using Compact Dry EC

Lời nói đầu

TCVN 13875:2023 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG NHANH ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA COMPACT DRY EC

Microbiology of the food chain - Rapid enumeration of Escherichia coli and coliforms by the method using Compact Dry EC

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa Compact Dry EC để định lượng nhanh 1) Escherichia coli (ngoại trừ chủng E. coli O157) và tổng số coliform trong thực phẩm.

Phụ lục A cung cấp thông tin về kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và kết quả của các phép thử liên phòng thử nghiệm do các tổ chức AOAC ^{[9],[13],[14]}, NMKL - NordVal ^[11] và Microval ^[12] thực hiện.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Escherichia coli

E. coli

Vi khuẩn ở nhiệt độ 37 °C hình thành các khuẩn lạc điển hình có màu xanh lam hoặc xanh tím trên môi trường với các điều kiện được quy định trong tiêu chuẩn này

3.2

Coliform (coliforms)

Vi khuẩn ở nhiệt độ 37 °C hình thành các khuẩn lạc điển hình có màu xanh lam, xanh tím, hồng hoặc đỏ trên môi trường với các điều kiện được quy định trong tiêu chuẩn này

3.3

Khuẩn lạc (colony)

Cụm sinh khối vi sinh vật tại một vị trí, có thể nhìn thấy, phát triển trên hoặc trong môi trường dinh dưỡng đặc từ một phần tử sống

4  Nguyên tắc

Sử dụng đĩa môi trường chuẩn bị sẵn bao gồm môi trường nuôi cấy, chất tạo gel và hai cơ chất enzym tạo màu. Đĩa chứa môi trường được làm ẩm bằng phần mẫu thử đã chuẩn bị, sau đó chất tạo gel sẽ làm môi trường hóa rắn. Ủ môi trường chứa phần mẫu thử ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 2 h. E. coli hình thành các khuẩn lạc màu xanh lam hoặc xanh tím và các vi khuẩn coliform khác với E. coli hình thành các khuẩn lạc màu đỏ hoặc hồng.

CHÚ THÍCH 1: Các vi khuẩn không phải coliform bị ức chế và sẽ không hình thành các khuẩn lạc màu xanh lam, xanh tím, hồng hoặc đỏ điển hình.

CHÚ THÍCH 2: E. coli O157 không sinh beta-glucuronidase nên không được phát hiện là E. coli trên đĩa Compact Dry EC. E. coli O157 hình thành khuẩn lạc màu đỏ hoặc hồng trên đĩa Compact Dry EC.

5  Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

5.1  Đĩa Compact Dry EC

Đĩa Compact Dry EC gồm hỗn hợp các chất dinh dưỡng (pepton, kali nitrat, natri clorua và natri pyruvat), đệm phosphat, các chất chọn lọc đối với vi khuẩn Gram dương, chất tạo gel (polysaccharid có nguồn gốc từ thạch) và hai cơ chất enzym tạo màu là 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D galactopyranoside (Magenta-GAL) và muối cyclohexylamoni của axit 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic (X-Gluc).

Kích thước của đĩa là 20 cm², mặt sau của đĩa có lưới ô vuông 1 cm × 1 cm và 0,5 cm × 0,5 cm để thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.

Bảo quản đĩa ở nhiêt độ từ 1 °C đến 30 °C.

5.2  Dung dịch muối pepton (MRD)

5.2.1  Thành phần

5.2.2  Chuẩn bị

Hoà tan các thành phần vào nước đựng trong bình hoặc chai dung tích 1 000 mL bằng cách đun nóng, nếu cần. Khử trùng 15 min bằng nồi hấp áp lực (6.3) ở 121 °C.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ 25 °C, nếu cần.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

6.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

6.2  Dụng cụ đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

6.3  Nồi hấp áp lực, có thể kiểm soát ở nhiệt độ 121 °C.

6.4  Bình định mức, dung tích 1 000 mL.

6.5  Pipet, có thể phân phối thể tích 1 mL.

6.6  Máy trộn Vortex.

6.7  Túi trộn nhu động, có màng lọc, ví dụ: Stomacher bag.

6.8  Thiết bị đồng hóa mẫu, ví dụ: Blender hoặc Stomacher.

6.9  Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ 37 °C ± 1 °C.

6.10  Bộ đếm khuẩn lạc.

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 11923 (ISO/TS 17728) ^[6]; đối với lấy mẫu bề mặt thân thịt theo TCVN 7925 (ISO 17604)^[5], lấy mẫu sữa và sản phẩm sữa theo TCVN 6400 (ISO 707) ^[1].

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

8  Chuẩn bị mẫu thử

8.1  Chuẩn bị phần mẫu thử, theo phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887).

8.2  Chuẩn bị huyền phù mẫu thử

8.2.1  Mẫu thực phẩm dạng rắn

Cân 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào thiết bị đồng hóa mẫu (6.8) và thêm 90 mL dung dịch muối pepton (5.2). Trộn bằng thiết bị đồng hóa mẫu trong thời gian 2 min ± 15 s.

Đối với các mẫu thử dạng bột, cân 10 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào túi trộn nhu động (6.7) và thêm vào 90 mL dung dịch muối pepton (5.2) được làm ấm trước ở nhiệt độ 45 °C ± 1 °C. Xoay và lắc từ từ cho đến khi mẫu hòa tan.

CHÚ THÍCH: Sử dụng túi trộn nhu động có màng lọc để tránh để lại các mảnh nhỏ lên bề mặt môi trường nuôi cấy.

8.2.2  Mẫu thực phẩm dạng lỏng

Đối với các mẫu thử dạng lỏng, tùy thuộc mức độ nhiễm E. coli và coliform dự kiến, có thể sử dụng trực tiếp phần mẫu thử không pha loãng hoặc tiến hành pha loãng 1 mL phần mẫu thử trong 9 mL dung dịch muối pepton (5.2) hoặc pha loãng tiếp theo nếu số đếm lớn hơn 250 CFU/đĩa 1).

Trộn bằng máy trộn Vortex (6.6).

9  Cách tiến hành

9.1  Lấy số đĩa Compact Dry EC (5.1) cần sử dụng. Nếu cần đếm khuẩn lạc ở các độ pha loãng liên tiếp thì sử dụng một bộ bốn đĩa. Ghi nhãn đĩa với thông tin về mẫu thử và độ pha loãng.

9.2  Mở nắp đĩa, dùng pipet (6.5) lấy 1 mL phần mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 8), cho vào giữa và đậy nắp dĩa. Phần mẫu thử sẽ khuếch tán tự động và đồng đều trên toàn bộ môi trường để chuyển thành dạng gel.

Cần thao tác cẩn thận để tránh ô nhiễm vi sinh vật.

Các mẫu có độ nhớt cao, màu đậm hoặc độ pH quá cao hoặc phản ứng với chất chỉ thị oxy hóa khử có thể ảnh hưởng đến kết quả. Đối với các mẫu như vậy, chỉ phân tích sau khi pha loãng mẫu, điều chỉnh pH của mẫu bằng dung dịch đệm hoặc các biện pháp khác.

9.3  Lật ngược đĩa đã đậy nắp và đặt vào tủ ấm (6.9), ủ đĩa ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C trong thời gian 24 h ± 2 h.

Trong thời gian ủ, cần giữ kín nắp đĩa để tránh thất thoát ẩm.

9.4  Đếm các khuẩn lạc có màu trong môi trường nuôi cấy, sử dụng bộ đếm khuẩn lạc (6.10). Khuẩn lạc E. coli (ngoại trừ chủng E. coli O157) có màu xanh lam hoặc xanh tím, khuẩn lạc của các vi khuẩn coliform khác với E. coli có màu đỏ hoặc màu hồng, do đó tổng số coliform là tổng số khuẩn lạc màu xanh lam, xanh tím, đỏ và hồng, có thể đặt tấm giấy trắng ở phía dưới đĩa để thuận tiện việc đếm khuẩn lạc.

Việc đếm trên đĩa cần được điều chỉnh theo hệ số pha loãng.

Khi khó đếm khuẩn lạc do có số lượng lớn khuẩn lạc mọc trong môi trường, có thể tính tổng số khuẩn lạc bằng 20 lần số khuẩn lạc trung bình từ các ô đại diện 1 cm × 1 cm hoặc bằng 80 lần số khuẩn lạc trung bình từ các ô đại diện 0,5 cm × 0,5 cm, các ô này được đếm ở bốn góc của đĩa.

9.5  Phạm vi đếm khuẩn lạc là từ 1 CFU/đĩa đến 250 CFU/đĩa. Nếu đĩa đếm có số khuẩn lạc lớn hơn 250 CFU/đĩa thì pha loãng mẫu thử bằng dung dịch pha loãng thích hợp.

10  Tính và biểu thị kết quả

a) Tính số lượng vi sinh vật (E. coli hoặc tổng số coliform) có trong mẫu thử, N, theo trung bình số khuẩn lạc từ hai độ pha loãng liên tiếp, áp dụng Công thức (1):

Trong đó:

ΣC  là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa với hai độ pha loãng liên tiếp, trong đó có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc;

V  là thể tích dịch cấy được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (V = 1 mL);

d  là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng đầu tiên được giữ lại (d = 1 khi đĩa đầu tiên được giữ lại là đĩa cấy mẫu thử dạng lỏng không pha loãng).

b) Nếu các đĩa không chứa khuẩn lạc nào thì báo cáo kết quả là:

“Có ít hơn  trên gam sản phẩm”

Trong đó:

V  là thể tích dịch cấy được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (V = 1 mL);

d  là độ pha loãng tương ứng với mỗi đĩa được giữ lại.

c) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một đĩa trong khoảng từ 1 CFU/đĩa đến 3 CFU/đĩa thì báo cáo kết quả là:

“Có măt E. coli (hoặc tổng số coliform) nhưng ít hơn  CFU trên gam sản phẩm”.

d) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một đĩa trong khoảng từ 4 CFU/đĩa đến 9 CFU/đĩa thì tính số ước tính N_E E. coli (hoặc tổng số coliform) trên gam sản phẩm theo Công thức (2):

Trong đó:

C  là số khuẩn lạc đếm được trên đĩa.

e) Trường hợp chỉ có đĩa chứa dung dịch pha loãng được nuôi cấy cuối cùng có thể đếm và có chứa từ 10 CFU/đĩa đến 250 CFU/đĩa, thì tính số lượng E. coli (hoặc tổng số coliform) có trên gam sản phẩm, N’, áp dụng Công thức (3):

f) Nếu số đếm khuẩn lạc trên một trong các đĩa có tất cả các dung dịch pha loãng đã nuôi cấy, cho số lượng E. coli (hoặc tổng số coliform) lớn hơn 250 CFU/đĩa, thì báo cáo kết quả là:

“Có nhiều hơn  trên gam sản phẩm”

11  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

f) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và phép thử liên phòng thử nghiệm

A.1  Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp do AOAC thực hiện

Các thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này do AOAC thực hiện lần đầu năm 2006 ^[13], bổ sung vào các năm 2016 ^[14] và 2020 ^[9].

A.1.1  Thử nghiệm về độ chọn lọc mục tiêu và độ chọn lọc loại trừ

Kết quả thử nghiệm về độ chọn lọc mục tiêu của phương pháp đối với E. coli và các loài coliform khác được nêu trong Bảng A.1. Kết quả thử nghiệm về độ chọn lọc loại trừ của phương pháp đối với các loài vi sinh vật không phải coliform được nêu trong Bảng A.2.

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm về độ chọn lọc mục tiêu của phương pháp đối với E. coli và các loài coliform khác

Bảng A.2 - Kết quả thử nghiệm về độ chọn lọc loại trừ của phương pháp đối với các loài không phải coliform

A.1.2  Thử nghiệm so sánh kết quả định lượng E. coli và coliform theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với các phương pháp chuẩn

Kết quả thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn nêu trong AOAC 966.24^[8] đối với E. coli và coliform được nêu trong Bảng A.3.

Kết quả thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn nêu trong TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) ^[4] đối với E. coli được nêu trong Bảng A.4.

Kết quả thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn nêu trong TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007) ^[3] đối với coliform được nêu trong Bảng A.5.

Bảng A.3 - Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng E. coli và coliform nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn

Bảng A.4 - Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng E. coli nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn [TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)]

Bảng A.5 - Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng coliform nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn [TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007)]

A.1.3  Thử nghiệm đánh giá độ chụm đối với E. coli và coliform

a) Đánh giá độ chụm đối với E. coli

Thử nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp có 14 phòng thử nghiệm tham gia, trong đó dữ liệu thống kê được lấy từ 9 phòng thử nghiệm. Mẫu thử sữa thanh trùng được cấy E. coli với lượng xác định. Kết quả được nêu trong Bảng A.6.

Bảng A.6 - Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp định lượng E. coli nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn [TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)]

b) Đánh giá độ chụm đối với coliform

Thử nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp có 14 phòng thử nghiệm tham gia, trong đó dữ liệu thống kê được lấy từ 11 phòng thử nghiệm. Mẫu thử sữa thanh trùng được cấy các vi khuẩn coliform với lượng xác định. Kết quả được nêu trong Bảng A.7.

Bảng A.7 - Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp định lượng coliform nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn [TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007)]

A.2  Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp do NMKL - NordVal International thực hiện

Thử nghiệm xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng E. coli và coliform nêu trong tiêu chuẩn này so với phương pháp chuẩn do NMKL - NordVal International thực hiện năm 2008 và bổ sung năm 2020 ^[11].

a) Đánh giá độ chụm đối với E. coli

Thử nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp có 13 phòng thử nghiệm tham gia, trong đó dữ liệu thống kê được lấy từ 9 phòng thử nghiệm (có 2 phòng thử nghiệm bị loại do không thực hiện phép thử đúng thời gian đã định và 2 phòng thử nghiệm bị loại do lỗi khi thực hiện phép thử E. coli theo phương pháp chuẩn), Mẫu thử sữa thanh trùng được cấy E. coli với lượng xác định, Kết quả được nêu trong Bảng A.8.

Bảng A.8 - Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp định lượng E. coli nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn [TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)]

b) Đánh giá độ chụm đối với coliform

Thử nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp có 11 phòng thử nghiệm tham gia. Mau thử sữa thanh trùng được cấy các vi khuẩn coliform với lượng xác định. Kết quả được nêu trong Bảng A.9.

Bảng A.9 - Kết quả đánh giá độ chụm của phương pháp định lượng coliform nêu trong tiêu chuẩn này (TCVN 13875:2023) so với phương pháp chuẩn [TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007)]