Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14173:2024 Thuốc bảo vệ thực vật - Phương pháp định lượng Streptomyces lydicus - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14173:2024

THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STREPTOMYCES LYDICUS - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Pesticides- Enumeration of Streptomyces lydicus - The plate count method

Lời nói đầu

TCVN 14173:2024 do Trường Đại học Khoa học Tự nhiên biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STREPTOMYCES LYDICUS - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

Pesticides- Enumeration of Streptomyces lydicus - The plate count method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng S. lydicus trong thuốc bảo vệ thực vật hoặc nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Tiêu chuẩn này sử dụng quy trình real-time PCR cho phép thử khẳng định S. lydicus.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 6166, Phân bón vi sinh vật cố định nitơ.

TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi Polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.

TCVN 7700-2 (ISO 11290-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes. Phần 2: Phương pháp định lượng.

TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước. Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

TCVN 11133 (ISO 22119), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung.

TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Định nghĩa và yêu cầu chung.

TCVN 11925 (ISO 20837), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính.

TCVN 12017, Thuốc bảo vệ thực vật - Lấy mẫu.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau:

3.1

Môi trường nuôi cấy Streptomyces (Streptomyces medium - International Streptomyces Project medium 4 hoặc Inorganic salts-starch agar - ISP4)

Là môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuộc nhóm Streptomyces, giúp đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit - CFU).

3.2

Khuẩn lạc S. lydicus giả định (Putative S. lydicus Colony - PSC)

Là khuẩn lạc mang các đặc điểm phù hợp với các mô tả về khuẩn lạc của S. lydicus trên môi trường ISP4, khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này và chưa qua phép thử khẳng định.

3.3

Phép thử khẳng định S. lydicus (S. lydicusconfirmation)

Là phương pháp kiểm tra định tính các khuẩn lạc S. lydicus giả định (3.2) là đúng hay sai, khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.4

Streptomyces lydicus (Streptomyces lydicus)

Là vi sinh vật tạo thành khuẩn lạc S. lydicus giả định trên môi trường ISP4 và được khẳng định đúng với phép thử khẳng định S. lydicus, khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.5

Định lượng S. lydicus (S. lydicusenumeration)

Là xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc S. lydicus (3.4) có trong một khối lượng hoặc thể tích cụ thể của thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật, khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.6

Real-time PCR

Là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực cho phép theo dõi sự gia tăng và định lượng DNA mục tiêu trong mẫu thử trong suốt thời gian thực tế diễn ra phản ứng nhờ vào công nghệ phát huỳnh quang.

3.7

Giá trị chu kỳ ngưỡng(Threshold cycle value - Ct)

Là giá trị chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang được tạo ra vượt ngưỡng huỳnh quang nền, trong quy trình real-time PCR (phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực).

3.8

Đường cong nóng chảy và giá trị Tm(Melting curve analysis and Tm value)

Đường cong nóng chảy là đồ thị biểu diễn sự thay đổi của nhiệt độ trong các bước của quy trình real-time PCR. Đỉnh cao nhất của đường cong nóng chảy thể hiện giá trị Tm, đại diện cho mẫu nghiên cứu.

Giá trị Tm là điểm nhiệt độ mà tại đó 50 % sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo thành sợi đơn.

4  Nguyên tắc

Định lượng S. lydicus trong thuốc bảo vệ thực vật, nguyên liệu sản xuất thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp đếm PSC (3.2) trên đĩa thạch ISP4 và xác định số lượng PSC (3.2) là đúng S. lydicus (3.4) bằng phương pháp real-time PCR.

Phép phân tích nhìn chung bao gồm:

a. Đếm số lượng khuẩn lạc S. lydicus giả định PSC (3.2), trên đĩa thạch ISP4;

b. Thực hiện phép thử khẳng định khuẩn lạc S. lydicus (3.3);

c. Khẳng định số lượng khuẩn lạc đúng S. lydicus (3.4) dựa theo giá trị Ct;

d. Từ số lượng khuẩn lạc đã khẳng định, áp dụng công thức tính để định lượng S. lydicus (3.5).

5  Thiết bị, dụng cụ

Cần sử dụng trang thiết bị và dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh theo TCVN 6404 (ISO 7218).

Thiết bị và dụng cụ để thực hiện quy trình real-time PCR cần được trang bị theo TCVN 11133 (ISO 22119).

5.1  Thiết bị

Trang thiết bị của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN 11133 (ISO 22119) và TCVN 11134 (ISO 22174) cần sử dụng các thiết bị, dụng cụ như sau:

5.1.1  Tủ cấy vô trùng, tủ cấy vi sinh, luồng không khí thổi theo chiều dọc.

5.1.2  Nồi hấp áp lực, có nhiệt độ hơi nước bão hòa trong buồng có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C ± 3 °C tương ứng áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

5.1.3  Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến ± 0,01 g.

5.1.4 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 40 °C, độ chính xác đến ± 1 °C.

5.1.5  Tủ lạnh, với ngăn đông duy trì nhiệt độ ổn định ở âm 20 °C ± 1 °C và ngăn lạnh duy trì nhiệt độ ổn định ở 4 °C ± 1 °C.

5.1.6 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh tự động về nhiệt độ trong khoảng từ 5 °C đến 99 °C, độ chính xác đến ± 1 °C.

5.1.7  Máy trộn mẫu (máy vortex), có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.

5.1.8 Máy quang phổ, định lượng ADN/ARN có phạm vi bước sóng từ 200 nm đến 850 nm, độ chính xác bước sóng ± 1 nm.

5.1.9  Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,01 đơn vị pH ở nhiệt độ phòng.

5.1.10 Máy chu trình nhiệt (máy real-time PCR), phần nhiệt với khả năng luân nhiệt ở nhiệt độ khác nhau trong phạm vi từ 4 °C đến 115 °Cmột cách chính xác và quá trình luân nhiệt này được lặp đi lặp lại từ 30 đến 45 chu kỳ. Phần quang dùng để ghi nhận (detector) nhiều tín hiệu quang phát ra cùng lúc (theo mục 7.2.1 TCVN 11133).

5.1.11 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

5.1.12  Kính hiển vi quang học, có vật kính dầu với độ phóng đại 100X.

5.1.13  Máy lắc ổn nhiệt, có tốc độ lắc từ 0 rpm đến 280 rpm, có khả năng chỉnh nhiệt độ.

5.2  Dụng cụ

5.2.1  Ống ly tâm, 1,5 mL.

5.2.2  Bộ Pipet, cho các kích cỡ từ 1 μL đến 10 μL, 20 μL đến 200 μL, 100 μL đến 1000 μL.

5.2.3 Đầu côn, 1 mL; 200 μL; 20 μL; 10 μL

5.2.4  Ống real-time PCR, thể tích từ 100 μL đến 200 μL.

5.2.5  Bình thủy tinh có nút vặn, thể tích phù hợp (100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL).

5.2.5  Bình định mức, 500 mL, 1000 mL.

5.2.7  Que cấy vi sinh, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.

5.2.8  Ống falcon, có nắp vặn, vô trùng.

5.2.9  Đĩa Petri, đường kính từ 90 mm đến 200 mm.

5.2.10  Đèn cồn

5.2.11  Khay đá, giữ lạnh mẫu.

5.2.12  Lamen, bằng thủy tinh.

5.2.13 Lam kính, bằng thủy tinh.

6  Môi trường, thuốc thử và vật liệu thử

6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng môi trường ISP4 hoàn chỉnh (3.1), tuân thủ chính xác hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuẩn bị môi trường trong phòng thử nghiệm theo Điều 4.3 TCVN 8128 (ISO 11133).

Yêu cầu chung cho nước, thuốc thử và vật liệu thử cho quy trình real-time PCR theo TCVN 11133 (ISO 22119).

6.2  Dung dịch pha loãng

Chuẩn bị dung dịch pha loãng Natri clorua (NaCl) 0,85 % theo mục 6.2.1.2 của TCVN 6166.

6.3  Môi trường ISP4

6.3.1 Thành phần

Thành phần môi trường ISP4 để nuối cấy S. lydicus bao gồm:

Tinh bột tan (Soluble Starch)	10g
MgSO4 × 7 H2O	1 g
NaCl	1 g
(NH4)2SO4	2g
CaCO3	2 g
Nước cất	1 L
Dung dịch muối vi lượng bao gồm: FeSO4 × 7 H2O: 0,1 g MnCl2x4 H2O: 0,1 g ZnSO4 × 7 H2O: 0,1 g Nước cất: 100 mL	1 mL
Bột thạch (agar)	20 g
pH 7,0 đến 7,4

CHÚ THÍCH: Ưu tiên sử dụng môi trường pha sẵn. Sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.2  Chuẩn bị

Để pha 1000 mL môi trường từ các thành phần nêu tại mục 6.3.1, các bước thực hiện như sau: Môi trường được chuẩn bị dưới dạng hai dung dịch riêng biệt. Dung dịch 1: Tạo một hỗn hợp từ tinh bột hòa tan với một lượng nhỏ nước cất lạnh; đưa hỗn hợp này đến thể tích 500 mL. Dung dịch 2: Hòa tan các thành phần còn lại và dung dịch muối vi lượng theo tỷ lệ ở mục 6.3.1 trong 500 mL nước cất; điều chỉnh pH sao cho nằm trong khoảng từ 7 đến 7.4; trộn đều hai dung dịch; bổ sung bột thạch theo tỷ lệ tương ứng 20 g/1000 mL môi trường; khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (5.1.2) ở 121 °C; làm nguội môi trường trong khoảng từ 50 °C đến 60 °C; phân phối môi trường vào các đĩa Petri (5.2.9) với thể tích từ 18 mL đến 20 mL trong tủ cấy vô trùng (5.1.1). Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng (đảm bảo không có các giọt nước trên bề mặt môi trường) bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm (5.1.4) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 35 °C trong 25 min đến 30 min hoặc để qua đêm.

CHÚ THÍCH: Đĩa môi trường chỉ được sử dụng khi xác định không bị tạp nhiễm với nấm và vi khuẩn.

6.4  Cặp mồi real-time PCR

Cặp mồi được thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu theo Điều 7.5 TCVN 7682 (ISO 20838).

Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn ADN dài bp, sử dụng cho phép thử khẳng định S. lydicus (3.3) bằng quy trình real-time PCR, với trình tự mồi (5’ - 3') như sau:

6.5  Vật liệu ADN

Vật liệu ADN sử dụng trong phép thử khẳng định S. lydicus (3.3) bao gồm một ADN đối chứng dương (Positive control -PC), một ADN đối chứng âm (Negative control - NC) và ADN từ khuẩn lạc S. lydicus giả định (Testing colony - TC).

6.5.1  Đối chứng dương

Chủng chuẩn S. lydicus tiếp nhận từ bộ sưu tập chủng của Liên đoàn thế giới các Bảo tàng giống vi sinh vật (WFCC) hoặc Tổ chức Bảo tàng giống vi sinh vật châu Âu (ECCO) theo TCVN 8128 (ISO 11133).

CHÚ THÍCH: Chủng chuẩn S. lydicus được ghi nhận trên Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI), bao gồm CGMCC:4.1412, ATCC:25470, CBS:703.69, BCRC:11919, CECT:3163, DSM:40461, HAMBI:1063, IFO:13058. NBRC:13058, IMET:43531, JCM:4492, BCCM/LMG:19331, NCIMB:12977, NRRL:2433, NRRL-ISP:5461, RIA:1250, VKM:Ac:1869, ISP:5461.

6.5.2  Đối chứng âm

Chủng chuẩn không phải là S. lydicus, tiếp nhận từ bộ sưu tập chủng của Liên đoàn thế giới các Bảo tàng giống vi sinh vật (WFCC) hoặc Tổ chức Bảo tàng giống vi sinh vật châu Âu (ECCO) theo TCVN 8128 (ISO 11133).

6.5.3  Tách chiết ADN từ khuẩn lạc

Phương pháp này áp dụng cho tách chiết ADN vi khuẩn từ khuẩn lạc với đối chứng dương (6.5.1), đối chứng âm (6.5.2) và các khuẩn lạc S. lydicus giả định. Để ngăn ngừa nhiễm chéo, không thực hiện tách chiết ADN của đối chứng dương (6.5.1), đối chứng âm (6.5.2) và PSC (3.2) cùng thời điểm.

Để đảm bảo độ tinh khiết của ADN và tính chính xác cho phép thử khẳng định S. lydicus bằng phương pháp real-time PCR, khuyến nghị sử dụng bộ kít thương mại tách chiết ADN dành cho vi sinh vật. Thực hiện quy trình tách chiết ADN theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể thực hiện tách chiết ADN từ dịch nuối cấy vi khuẩn (Tham khảo phụ lục C).

Định lượng ADN bằng máy quang phổ (5.1.8) và kiểm tra độ tinh sạch theo mục 6.2.1.2 của TCVN 11925 (ISO 20837). Nồng độ ADN thu được nên tối thiểu là 50 ng trong 1 μL dịch ADN.

ADN sau tách chiết cần được bảo quản trong ngăn lạnh tủ lạnh (5.1.5) trong vòng 24 h nếu sử dụng ngay cho phép thử khẳng định S. lydicus, hoặc nếu chưa tiến hành phản ứng ngay thì cần lưu trữ trong ngăn đông tủ lạnh (5.1.5).

6.6  Thuốc thử để ngăn ngừa lây nhiễm chéo

Ngăn ngừa nhiễm chéo theo mục 5.9.4 TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006).

6.7 Kít real-time PCR

Sử dụng thuốc thử thương mại cho quy trình real-time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green (SYBR Green Master Mix). Việc pha chế, bảo quản và sử dụng thuốc thử phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

7  Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử

7.1  Lấy mẫu

Thuốc bảo vệ thực vật được lấy mẫu theo quy định (TCVN 12017) về cách lấy mẫu, số lượng mẫu và bảo quản mẫu trước khi đưa đến phòng thử nghiệm.

Mẫu sau khi được tiếp nhận ở phòng thử nghiệm được bảo quản theo khuyến cáo của nhà sản xuất nhằm đảm bảo sức sống của các tế bào vi khuẩn trong thuốc bảo vệ thực vật.

7.2  Chuẩn bị mẫu thử

Đối với mẫu dạng lỏng, lắc đều và dùng pipet (5.2.2) hút 10 mL, chính xác đến 10 μL vào bình thủy tinh có nắp vặn vô trùng thể tích 250 ml (5.2.5). Đối với mẫu dạng rắn, cân 10 gram vào vào bình thủy tinh có nắp vặn vô trùng thể tích 250 mL (5.2.5) bằng cân kỹ thuật (5.1.3). Bổ sung 90 mL dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (6.2) vô trùng để thu được độ pha loãng 10^-1. Trộn đều mẫu bằng máy trộn mẫu (5.1.7) trong 5 min đến 10 min (nếu mẫu chưa đồng nhất, tiếp tục ủ mẫu khoảng từ 5 min đến 10 min rồi tiếp tục trộn).

CHÚ THÍCH: Mẫu pha loãng 10^-1 được tiếp tục sử dụngđể pha loãng ở các nồng độ thấp hơn. Mẫu tiếp tục được pha loãng từ 10^-2 đến 10^-8 trong dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (6.2) với thể tích của mỗi nồng độ pha loãng là 10 mL đựng trong ống falcon vô trùng (5.2.8) hoặc bình thủy tinh thể tích phù hợp (5.2.5). Các mẫu pha loãng sẽ được sử dụng ngay để thực hiện ở Điều 8.1.

8  Cách tiến hành

8.1  Cấy trải mẫu trên đĩa thạch

Sử dụng 100 μL (0,1 mL) dịch đồng nhất của các mẫu pha loãng và cấy trải trên đĩa Petri (5.2.9) rồi chuyển các đĩa này vào tủ ấm (5.1.4) ở 29 °C ± 1 °C. Kiểm tra các đĩa nuôi cấy sau mỗi 24 h (trong7 ngày), cho đến khi không thấy xuất hiện khuẩn lạc mới. Giữ lại các đĩa nuôi cấy có chứa ít hơn 200 khuẩn lạc trong tủ lạnh (5.1.5) để thực hiện việc nhận diện, đếm khuẩn lạc S. lydicus giả định (PSC) và thực hiện phép thử khẳng định S. lydicus.

Để quan sát cuống sinh bào tử, mẫu kiểm định được nuôi cấy trên môi trường ISP4 có đặt lamen (5.2.12) nghiêng 45 độ trên đĩa thạch, chuyển vào tủ ấm (5.1.4) ở 29 °C ± 1 °C, nuôi từ 5 ngày đến 7 ngày, sau đó đặt lamen (5.2.12) vào lam kính (5.2.13) rồi quan sát hình dạng cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi dưới vật kính 100x (5.16 TCVN 6404)

8.2  Nhận diện khuẩn lạc

Khuẩn lạc S. lydicus trên môi trường ISP4 sau 5 ngày đến 7 ngày nuôi cấy có màu trắng, kích thước từ 3 mm đến 4 mm, hình dạng tròn, hơi nhô lên ở giữa tạo thành dạng vòm. Bề mặt khuẩn lạc khô, có dạng lông, mềm mịn như nhung. Cuống sinh bào tử của S. lydicus có dạng thẳng RF (Recti-flexibiles) (Hình thái khuẩn lạc tham khảo Phụ lục A).

8.3  Đếm khuẩn lạc S. lydicus giả định

Đĩa nuôi cấy được giữ lại (8.1) đạt yêu cầu cho việc định lượng S. lydicus là đĩa có chứa các PSC (3.2) tách rời nhau.

Trong đĩa nuôi cấy có thể xuất hiện các khuẩn lạc mọc lan không mang các đặc điểm như mô tả cho S. lydicus (8.2). Nếu số khuẩn lạc mọc lan ít hơn một phần tư đĩa, thì đếm PSC trên phần đĩa không bị ảnh hưởng và tính bằng cách ngoại suy số đếm lý thuyết của các PSC cho toàn bộ đĩa. Nếu số khuẩn lạc mọc lan nhiều hơn một phần tư đĩa, thì không đếm PSC trên đĩa này.

Thực hiện đếm tất cả PSC trong các đĩa nuôi cấy giữ lại (8.1), ở 2 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng đếm trên 2 đĩa. Ưu tiên từ độ pha loãng thấp nhất và có tối thiểu 4 PSC.

8.4 Phép thử khẳng định S. lydicus

Phép thử khẳng định S. lydicus (3.3) nhằm định tính các PSC được thực hiện bằng phương pháp real-time PCR. Trên mỗi đĩa đã đếm PSC, chọn 5 khuẩn lạc điển hình, nêu trên một đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì lấy tất cả để tách chiết ADN (6.5.3) làm vật liệu (khuôn mẫu ADN) cho phép thử khẳng định.

8.4.1  Quy trình real-time PCR

Kỹ thuật real-time PCR sử dụng cặp mồi qPCR.SI.F/ qPCR.SI.R có trình tự tại Điều 6.3, sử dụng kít real-time PCR (6.7). Mỗi quy trình real-time PCR, ngoài mẫu TC, cần tiến hành song song 1 mẫu PC (6.5.1), 1 mẫu NC (6.5.2), và 1 mẫu nước không chứa ADN/ARN (Bảng 1).

Bảng 1 - Hỗn hợp thuốc thử cho một mẫu tham gia quy trình real-time PCR

STT	Thành phần	Nồng độ cuối
1	Nước*
2	qPCR.SI.F1	0,1 μM/μL
3	qPCR.SI.R1	0,1 μM/μL
4	qPCR.SI.F2	0,1 μM/μL
5	qPCR.SI.R2	0,1 μM/μL
6	Kít real-time PCR	1x
7	ADN	~ 2,5 ng/μL
* CHÚ THÍCH: Nước được thêm vào cho đủ tổng thể tích phản ứng.

CHÚ THÍCH: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng real-time PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Đặt các ống real-time PCR đã hoàn thành bổ sung hỗn hợp thuốc thử vào máy chu trình nhiệt (5.1.10) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt 3 bước, với 40 chu kỳ, theo hướng dẫn của nhà sản xuất với thuốc thử SYBR Green Master Mix (6.7). Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi đặc hiệu trong phép thử này là 60 °C. Thực hiện các bước cài đặt theo các thông số nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Chu trình nhiệt cho quy trình real-time PCR có phân tích đường cong nóng chảy

Bước	Giai đoạn	Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
1	Biến tính ban đầu	95	10 min	1
2	Biến tính	95	15 s	40
	Gắn mồi	60	30 s
	Tổng hợp chuỗi	72	20 s
3	Phân tích đường cong nóng chảy	95	10 s	1
		65	20 s
		95	1 s

8.4.2 Phân tích kết quả

Quy trình real-time PCR cho phép thử khẳng định S. lydicus đạt yêu cầu khi mẫu PC (6.5.1) cho giá trị cho giá trị Ct ≤ 27, mẫu NC (6.5.2) và mẫu nước cho giá trị Ct > 30 hoặc không có giá trị Ct.

Với mẫu TC có giá trị Ct ≤ 27, khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là S. lydicus (3.4).

Với mẫu TC có giá trị Ct > 30 hoặc không có giá trị Ct, khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là không phải S. lydicus.

Với mẫu TC có giá trị 27 < Ct ≤ 30, mẫu thử cần được kiểm tra lại nồng độ ADN, và cần thực hiện lại quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có phân tích đường cong nóng chảy theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử SYBR Green Master Mix (6.7).

Phân tích kết quả quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có phân tích đường cong nóng chảy, nếu giá trị Ct ≤ 30, và thể hiện một đỉnh nóng chảy với Tm đạt từ 77 °C đến 85,5 °C, khác biệt ± 3 °C so với mẫu đối chứng dương, thì mẫu thử được xác định dương tính, và khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là S. lydicus (3.4) (Tham khảo Phụ lục B).

CHÚ THÍCH: Giá trị Tm phụ thuộc vào máy chu trình nhiệt (mục 7.2.1 TCVN 11133) và thuốc thử SYBR Green Master Mix (6.7). Tuy nhiên các mẫu thử được khẳng định là S. lydicus khi giá trịCt ≤ 30 và giá trị Tm của mẫu TC có thể khác biệt ± 3 °C so với giá trị Tm của mẫu PC, trong cùng một quy trình real-time PCR.

8.5  Tính và biểu thị kết quả định lượng S. lydicus

Phương pháp định lượng S. lydicus được thực hiện theo TCVN 7700-2 (ISO 11290-2).

và được tính theo Công thức (1):

Trong đó

N	số lượng CFU S. lydicus trong một đơn vị mẫu, ở dạng lỏng được tính bằng CFU trên mililit (CFU/mL), hoặc dạng khô được tính bằng CFU trên gam (CFU/g);
A	tính bằng phần trăm (%) số mẫu thử được khẳng định là S. lydicus (8.4.2) trên tổng số PSC tham gia phép thử (8.4).
	(Ví dụ trong 5 PSC tham gia phép thử khẳng định S. lydicus (8.4), có 4 mẫu thử được khẳng định là S. lydicus (8.4.2) thì A được tính là (4/5) × 100 % = 80 %.)
Σ C	tổng các PSC đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng liêntiếp, chỉ tính các đĩa có chứa tối thiểu 4 khuẩn lạc;
V	thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit (mL);
n1, n2	số đĩa có PSC được đếm ở hai độ pha loãng liên tiếp;
d	hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 khi mẫuthử ở dạng lỏng, không pha loãng].

Kết quả định lượng S. lydicus được làm tròn đến hai chữ số sau dấu phẩy.

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

 

Phụ lục A: Nhận diện khuẩn lạc S. lydicus

(Tham khảo)

Hình A.1. Hình thái khuẩn lạc của S. lydicus trên môi trường ISP4 sau 120 h nuôi cấy

Hình A.2. Hình dạng cuống sinh bào tử của S. lydicus

 

Phụ lục B: Phân tích kết quả phát hiện dựa trên phương pháp real-time PCR

(Tham khảo)

Hình B. Kết quả real-time PCR của đối chứng dương, mẫu kiểm nghiệm và đối chứng âm

 

Phụ lục C: Phương pháp tách chiết ADN vi khuẩn hoặc xạ khuẩn

(Tham khảo)

Phương pháp này áp dụng cho tách chiết ADN vi khuẩn từ dung dịch vi khuẩn tăng sinh (theo Kutchma et al., 1998 có sửa đổi).

C.1  Hoá chất

- Dung dịch đệm hồi tính: 25 mM Tris-HClpH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA

- Dung dịch tách chiết: 0,2 M NaOH, 1,0% SDS

- Lysozyme: 25 mg/mL

- CH₃COONa (NaOAc) 3 M

- Cồn tuyệt đối (lạnh)

- Đệm TE: 1mM EDTA, 10 mM Tris-HCl

C.2  Thực hiện tách chiết ADN

Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa được lấy bằng que cấy tiệt trùng (5.2.7) và cấy truyền tăng sinh trong dung dịch môi trường ISP4 nuôi lắc (5.1.14) trong tủ ấm ở 29 °C ± 1 °C trong 24 h, với tốc độ 200 rpm.

Dịch nuôi vi khuẩn được thu hồi sau 24 h nuôi cấy và tiến hành tách chiết ADN tổng số theo các bước sau:

1. Chuyển 1 mL dịch nuôi vi khuẩn vào ống ly tâm. Ly tâm với tốc độ 10 000 rpm trong 5 min, ở nhiệt độ phòng (5.1.11). Loại bỏ dung dịch phía trên, thu hồi sinh khối vi khuẩn.

2. Hoà tan cặn vi khuẩn trong 300 μL dung dịch đệm hồi tính.

3. Bổ sung 30 μL lysozyme và đảo ngược ống từ 3 đến 5 lần. Ủ mẫu ở 37 °C trong 1 h (15 min đảo ống một lần).

4. Bổ sung 400 μL dung dịch tách chiết và ủ ở 80 °C trong 5 min.

5. Phá vỡ tế bào bằng cách thêm 250 mg hạt thủy tinh đường kính 0,45 mm đã được khử trùng và vortex ở mức mạnh nhất trong 20 min.

6. Ly tâm với tốc độ 10 000 rpm trong 5 min, ở nhiệt độ phòng.

7. Chuyển phần dịch nổi bên trên sang ống ly tâm mới và bổ sung 0,1 V NaOAc 3 M, 1 V cồn tuyệt đối lạnh để kết tủa ADN từ dịch chiết.

8. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống nhẹ nhàng từ 3 đến 5 lần. Ủ ống ly tâm chứa dịch chiết đã bổ sung cồn tuyệt đối 5 min trong ngăn mát tủ lạnh.

9. Ly tâm với tốc độ 10000 rpm trong 5 min, ở nhiệt độ phòng.

10. Loại bỏ dịch trong bên trên, thu phần ADN kết tủa dưới đáy ống và để khô trong 30 min ở nhiệt độ phòng.

11. Hoà tan ADN kết tủa với 50 μL đệm TE.

ADN sau tách chiết được bảo quản ở 4 °C trong 24 h, hoặc bảo quản ở âm 20 °C nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Kutchma, A. J., Roberts, M. A., Knaebel, D. B., & Crawford, D. L, (1998). Small-scale isolation of genomic ADN from Streptomyces mycelia or spores. Biotechniques, 24(3), 452-457.