Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12753:2019 ISO 19020:2017 Phát hiện Staphylococcal enterotoxin trong thực phẩm

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12753:2019

ISO 19020:2017

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG ENZYM MIỄN DỊCH

Microbiology of food chain - Horizontal method for the immunoenzymatic etection of Staphylococcal enterotoxins in foodstuffs

Lời nói đầu

TCVN 12753:2019 hoàn toàn tương đương ISO 19020:2017;

TCVN 12753:2019 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Staphylococcal enterotoxin (SE) là các protein có thể được sinh ra trong thực phẩm từ một số chủng staphylococci dương tính coagulase (CPS), chủ yếu là Staphylococcus aureus. Đây là các độc tố bền nhiệt và axit gây ra triệu chứng nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy khi ăn phải. Do tính bền vững của chúng, các SE vẫn có thể có mặt ngay cả khi không phát hiện được tụ cầu khuẩn coagulase dương tính. Các SE thuộc một họ gồm hơn 20 protein đơn phân tử hình cầu với khối lượng phân tử từ 19 kDa đến 30 kDa^[1]. Những protein này tương đối ổn định trong các điều kiện môi trường thay đổi, như xử lý nhiệt, làm đông lạnh và thay đổi pH; ngoài ra, chúng chịu được phân hủy protein. Điển hình tùy thuộc vào độ mẫn cảm của từng người mà gây độc tố ở các mức nanogam (ng) khác nhau gây ra các triệu chứng nêu trên. Do ảnh hưởng của SE đến sức khỏe con người nên cần cập nhật các điều luật để làm tăng khả năng bảo vệ người tiêu dùng theo các tiêu chí xác định vi sinh vật, đối với thực phẩm như định lượng CPS và phát hiện SE ^[2].

Hiện đã có một vài phương pháp phát hiện và/hoặc định lượng SE. Một số phương pháp này dựa trên phân tích miễn dịch enzym (EIA), còn các phương pháp khác dựa trên phân tích hóa học sử dụng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) để phát hiện và định lượng SE. Vì các phương pháp LC-MS/MS này đang được nghiên cứu xây dựng, nên các phương pháp EIA đã được chọn làm điểm khởi đầu để chuẩn hóa phương pháp phát hiện các SE.

Mục đích của phương pháp là để phát hiện các SE sử dụng các bộ kit thương mại có sẵn. Tiêu chuẩn này mô tả nguyên tắc tách chiết các SE ra khỏi nền mẫu thực phẩm. Ngoài ra, các tiêu chí hiệu năng của các bộ kit đã được đánh giá trên năm nền mẫu thực phẩm trước khi sử dụng, dựa trên các tiêu chí nêu trong tiêu chuẩn này.

Tỷ lệ các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu khác nhau được mô hình hóa theo các liều ăn vào ^[3]. Với mục đích này, dữ liệu từ tài liệu cũng như dữ liệu của phòng thử nghiệm chuẩn của Liên minh Châu Âu về CPS đã được sử dụng.

Phương pháp luận về liều chuẩn của Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US EPA) đã được áp dụng cho bộ dữ liệu này và giúp thiết lập liều chuẩn (BMD). BMD được xác định như liều của mối nguy (Staphylococcal enterotoxin) có khả năng gây ra các triệu chứng về sức khỏe với tỷ lệ phần trăm dân số phơi nhiễm. Giới hạn dưới của BMD (BMDL) là khoảng tin cậy dưới 95 % (hoặc 90 %) của BMD. Giá trị này được sử dụng để thiết lập giá trị chấp nhận được đối với giới hạn phát hiện 50 (LOD₅₀) của các bộ kit phát hiện SE có bán trên thị trường.

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG ENZYM MIỄN DỊCH

Microbiology of food chain - Horizontal method for the immunoenzymatic etection of Staphylococcal enterotoxins in foodstuffs

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sàng lọc để phát hiện các loại Staphylococcal enterotoxin SEA, SEB, SEC, SED và SEE trong thực phẩm. Phương pháp này bao gồm hai bước chính: a) tách sau đó cô đặc dựa trên nguyên tắc thẩm tách và b) phát hiện enzym miễn dịch sử dụng bộ kit phát hiện thương mại bán sẵn.

Tiêu chuẩn này được áp dụng để sàng lọc các loại Staphylococcal enterotoxin từ SEA đến SEE trong các sản phẩm thực phẩm.

Các loại Staphylococcal enterotoxin khác như SEG, SEH, SEI, SER, SES và SET cũng có thể gây bệnh. Do chưa có các bộ kit phát hiện thương mại, nên tiêu chuẩn này chỉ áp dụng cho các kiểu loại từ SEA đến SEE, nhưng có thể áp dụng cho các loại độc tố khác, tùy thuộc vào việc đánh giá xác nhận của phương pháp.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1

Staphylococcal enterotoxin A, B, C, D, E (Staphylococcal enterotoxin A, B, C, D, E)

SEA, SEB, SEC, SED, SEE

exoprotein SEA, SEB, SEC, SED và SEE được tạo ra bởi các chủng staphylococci dương tính coagulase sinh độc tố ruột, chủ yếu là Staphylococcus aureus với khối lượng phân tử trong dải từ 19 kDa đến 30 kDa

3.2

Tính đặc hiệu (specificity)

SP

Số lượng mẫu được phát hiện âm tính trên tổng số mẫu trắng được thử nghiệm

3.3

Độ đáp ứng (sensitivity)

SE

Số lượng mẫu được tìm thấy là dương tính trên tổng số mẫu được thử nghiệm ở mức ô nhiễm nhất định

3.4

Giới hạn phát hiện 50 (limit of dectection 50)

LOD₅₀

Nồng độ (ng SE/g) mà xác suất phát hiện là 50 %

3.5

Liều chuẩn (benchmark dose)

BMD

Liều của một mối nguy (ví dụ: Staphylococcal enterotoxin) có khả năng gây ra các triệu chứng về sức khỏe với một tỷ lệ phần trăm nhất định của dân số bị phơi nhiễm

4  Nguyên tắc

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện Staphylococcal enterotoxin (SEA đến SEE) trong tất cả các loại thực phẩm, bao gồm hai bước chính: a) tách chiết sau đó cô đặc dựa trên nguyên tắc thẩm tách và b) phát hiện enzym miễn dịch sử dụng bộ kit phát hiện có bán sẵn.

5  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

5.1  Nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương theo TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2  Axit clohydric (ví dụ: nồng độ 5 N, 1 N hoặc độ pha loãng khác).

5.3  Natri hydroxit (ví dụ: nồng độ 5 N, 1 N hoặc độ pha loãng khác).

5.4  PBS (dung dịch muối đệm phosphat), pH 7,3 ± 0,2 [NaCl/Na₂HPO₄: 145 mM/10 mM].

5.5  PEG, khối lượng phân tử 20 000 g/mol (PolyEtylen Glycol).

Chuẩn bị dung dịch PEG đậm đặc: cân 30 g bột PEG và thêm 70 ml nước (5.1).

5.6  Dung dịch làm sạch điện cực (ví dụ: etanol 70 %).

5.7  Bộ kit phát hiện enzym miễn dịch dành riêng cho các SE. Bất kỳ bộ kit nào đều phải tuân thủ các tiêu chí hiệu năng trong 8.7.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [theo TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau.

6.1  Máy trộn.

6.2  Cân.

6.3  Thiết bị đồng hóa, ví dụ: bộ đồng hóa kiểu quay, bộ trộn hoặc bộ đồng hóa kiểu nhu động.

Khuyến khích sử dụng bộ đồng hóa kiểu quay, đặc biệt là cho tất cả các loại thực phẩm khó trộn để thu được mẫu đồng nhất. Nếu sử dụng bộ đồng hóa kiểu nhu động thì chỉ sử dụng túi không có bộ lọc.

6.4  Máy lắc ở nhiệt độ phòng, ví dụ: máy lắc quay, máy khuấy từ, v.v...

6.5  Máy đo pH và điện cực, ví dụ: điện cực kết hợp

6.6  Máy ly tâm, có khả năng hoạt động tối thiểu ở 3 130g; có thể được làm lạnh, nếu cần.

6.7  Màng lọc thẩm tách, ngưỡng khối lượng phân tử (MWCO) là 6 000 Da đến 8 000 Da.

6.8  Khóa dùng cho màng lọc thẩm tách.

6.9  Vật liệu lọc, ví dụ: phễu và bông thấm nước, bông thủy tinh, v.v...

6.10  Khay nông.

6.11  Tủ lạnh (duy trì ở 3 °C ± 2 °C hoặc 5 °C ± 3 °C) và tủ đông lạnh (≤ -18 °C).

6.12  Dụng cụ phòng thử nghiệm bằng thủy tinh hoặc polypropylen để tránh sự hấp phụ các chất độc (phễu, cốc, lọ, ống ly tâm, v.v...).

6.13  Dụng cụ thích hợp với bộ kit phát hiện được sử dụng, xem 5.7.

6.14  Nồi cách thủy (duy trì ở 38 °C ± 2 °C).

7  Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu.

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị phần mẫu thử

Trong trường hợp phomat có cùi, lấy khoảng 10 % cùi và 90 % phần lõi.

Vì các enterotoxin có thể phân bố không đồng đều trong mẫu, nếu có thể, trộn và đồng nhất toàn bộ mẫu hoặc một phần mẫu đại diện bằng bộ trộn (6.1). Sử dụng 25 g mẫu đồng nhất làm phần mẫu thử.

Trong trường hợp nghi ngờ bùng phát ngộ độc thực phẩm do tụ cầu (SFPO), thì cỡ mẫu thử có thể nhỏ hơn 25 g. Thực hiện phân tích như mô tả dưới đây và điều chỉnh các bước 8.3.1 đến 8.5.2 tương ứng. Tỷ lệ khối lượng của phần mẫu thử và chất chiết cô đặc (8.5.2.) phải xấp xỉ năm [ví dụ: phần mẫu thử từ 25 g cho 5,0 g đến 5,5 g dịch chiết cô đặc (tối đa 5,8 g đối với dịch chiết sánh), phần thử 12,5 g cho 2,5 g đến 2,8 g dịch chiết cô đặc (tối đa 2,9 g cho dịch chiết sánh)].

8.2  Bảo quản mẫu thử

Nên bảo quản mẫu thử ở 3 °C ± 2 °C hoặc 5 °C ± 3 °C (6.11) trước khi phân tích.

Nếu phân tích không được thực hiện trong vòng 24 h, có thể làm đông lạnh mẫu. Trong trường hợp này, cần rã đông hoàn toàn mẫu ở 3 °C ± 2 °C hoặc 5 °C ± 3 °C trước khi bắt đầu phân tích.

Để tránh thất thoát các độc tố, khuyến cáo không nên làm đông lạnh và rã đông mẫu nhiều lần trước khi phân tích.

8.3  Tách chiết

8.3.1  Thêm khoảng 40 ml nước (5.1) ở 38 °C ± 2 °C vào 25 g phần mẫu thử, trừ trường hợp sản phẩm dạng lỏng. Đối với các sản phẩm dạng lỏng, tiến hành trực tiếp như trong 8.3.2. Trong trường hợp SFPO, nếu phần mẫu thử nhỏ hơn 25 g thì giảm lượng nước (5.1) với tỷ lệ bằng nhau.

Đồng hóa hỗn hợp bằng bộ đồng hóa quay hoặc máy trộn (6.3). Bước này đặc biệt quan trọng trong trường hợp các sản phẩm có hàm lượng chất béo cao. Nên sử dụng bộ đồng hóa kiểu quay cho tất cả các loại mẫu thực phẩm khó trộn để thu được mẫu đồng nhất.

8.3.2  Thu lấy toàn bộ mẫu và rửa sạch hệ thống (thân của bộ đồng hóa kiểu quay, túi trộn kiểu nhu động hoặc bát của bộ trộn) với một lượng nước tối thiểu (5.1).

CHÚ THÍCH: Sử dụng lượng chất lỏng càng lớn thì thời gian thẩm tách càng dài.

8.3.3  Làm khuếch tán các độc tố bằng cách lắc mẫu (6.4) ở nhiệt độ phòng (18 °C đến 27 °C) trong 30 min đến 60 min.

8.3.4  Axit hóa hỗn hợp bằng các dung dịch axit clohydric thích hợp (5.2) để thu được độ pH trong khoảng từ 3,5 đến 4,0 đo được bằng máy đo pH (6.5).

8.3.5  Ly tâm toàn bộ hỗn hợp ở gia tốc tối thiểu 3 130g trong 15 min ở nhiệt độ lạnh (khoảng 4 °C) hoặc ở nhiệt độ phòng (18 °C đến 27 °C) (6.6).

Trong trường hợp mẫu giàu chất béo, nên ly tâm ở nhiệt độ lạnh (khoảng 4 °C) để loại bỏ các hạt chất béo trước khi thẩm tách.

8.3.6  Thu lấy phần nổi phía trên vào cốc (6.12). Nếu phần nổi phía trên đục thì lặp lại ly tâm như trong 8.3.5. Sau khi ly tâm, pH phải nằm trong khoảng từ 3,0 đến 4,5.

Nếu pH > 4,5 thì tiến hành theo 8.3.4.

Nếu pH < 3,0 thì cấu trúc 3D của các SE có thể bị hư hỏng. Lấy thêm 25 g phần mẫu thử khác và tiến hành theo 8.3.1.

8.3.7  Trung hòa hỗn hợp bằng các dung dịch natri hydroxit thích hợp (5.3) để thu được pH từ 7,4 đến 7,6.

Nếu pH > 9,0 thì cấu trúc 3D của các SE có thể bị hư hỏng. Lấy thêm 25 g phần mẫu thử và tiến hành theo 8.3.1.

8.3.8  Ly tâm theo 8.3.5.

8.3.9  Thu lấy toàn bộ pha nước trung hòa cho bước cô đặc.

Để thu được tối đa lượng độc tố, khi kết thúc các bước axit hóa và trung hòa, tráng rửa điện cực và cốc bằng một chút nước (5.1).

Trong trường hợp mẫu có hàm lượng chất béo cao, có thể làm sạch điện cực bằng cách sử dụng cồn 70 % (5.6) để hòa tan các hạt chất béo sau khi kết thúc quá trình phân tích.

8.3.10  Quy trình chiết thay thế (tùy chọn).

Quy trình thay thế này chỉ có thể sử dụng hạn chế trong các trường hợp như nghi ngờ ngộ độc thực phẩm và không được sử dụng cho sữa và các sản phẩm sữa. Quy trình thay thế này khác với quy trình được mô tả là bỏ qua bước cô thẩm tách.

- Lấy một lượng cần thiết (tùy thuộc vào bộ kit được sử dụng) pha nước trung hòa thu được ở bước 8.3.9 và tiến hành bước phát hiện 8.7. Bảo quản pha nước trung hòa còn lại ở 3 °C ± 2 °C hoặc 5 °C ± 3 °C.

- Nếu thu được kết quả âm tính SE, thực hiện bước cô đặc (8.4) pha nước trung hòa còn lại trong cùng ngày và lặp lại việc phát hiện bằng cách sử dịch chiết cô đặc.

Nếu quy trình này không được tuân thủ nghiêm ngặt, cần phân tích một phần mẫu thử mới.

8.4  Cô đặc dịch chiết (bắt buộc đối với sữa và các sản phẩm sữa)

8.4.1  Đối với từng mẫu, sử dụng dung dịch PEG đã được chuẩn bị theo 5.5.

8.4.2  Cắt một đoạn màng lọc thẩm tách (6.7) với chiều dài đủ để chứa toàn bộ dịch chiết.

8.4.3  Ngâm màng trong nước (5.1) để bù nước, theo hướng dẫn của nhà sản xuất (ví dụ: ít nhất 30 min ở nhiệt độ phòng).

Trước khi sử dụng, rửa sạch màng (bên ngoài và bên trong) bằng nước (5.1).

8.4.4  Khóa một đầu của màng bằng khóa dùng cho màng thẩm tách (6.8).

8.4.5  Đổ pha nước trung hòa (8.3.9) đầy màng đã chuẩn bị, dùng phễu và một miếng vật liệu lọc (6.9) nhỏ để lọc các hạt lơ lửng. Khóa đầu kia của màng bằng khóa (6.8) thứ hai.

8.4.6  Đặt màng lọc thẩm tách ở trên vào khay nông (6.10) chứa đầy dung dịch PEG (5.5).

8.4.7  Để dịch chiết cô đặc, qua đêm ở 3 °C ± 2 °C hoặc 5 °C ± 3 °C (6.11). Nếu dịch chiết không đủ đặc (nghĩa là còn lại hơn 5 ml trong màng thẩm tách) thì cho vào dung dịch PEG trong thời gian dài hơn (đến 3 ngày) hoặc thêm một ít bột PEG trên khắp màng.

8.5  Thu hồi dịch chiết cô đặc

8.5.1  Lấy màng thẩm tách ra khỏi dung dịch PEG và rửa sạch phần ngoài màng bằng nước (5.1) để loại bỏ tất cả các vết dung dịch PEG.

8.5.2  Mở một đầu màng và thu lấy dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kỹ phần bên trong màng thẩm tách bằng:

- PBS (5.4) trong trường hợp sữa và các sản phẩm từ sữa, hoặc

- nước (5.1) trong trường hợp các nền mẫu khác.

Rửa kỹ phần bên trong của màng thẩm tách để thu được khối lượng dịch chiết cô đặc cuối cùng trong dải từ 5,0 g đến 5,5 g (tối đa 5,8 g đối với dịch chiết sánh).

Cẩn thận chuyển dịch chiết cô đặc vào lọ thủy tinh hoặc lọ polypropylen (6.12).

Trong bước quan trọng này, để phục hồi lượng enterotoxin tối đa, nên:

- chà xát các phần bên trong màng thẩm tách (hai mặt màng úp vào nhau) để loại bỏ và thu hồi tối đa lượng SE, và

- tối đa hóa lượng SE thu được, tiến hành thu hồi dịch chiết bằng cách liên tục thêm một lượng nhỏ PBS (5.4) hoặc nước (5.1) vào màng (ví dụ thêm 1 ml hoặc 2 ml), chà xát màng như mô tả ở trên và thu hồi dịch chiết vào lọ. Lặp lại các bước này cho đến khi đạt được khối lượng cuối cùng từ 5,0 g đến 5,5 (5,8) g trên 25 g phần mẫu thử thu được.

Trong trường hợp SFPO, khối lượng mẫu được phân tích có thể nhỏ hơn 25 g (8.2). Khối lượng cuối cùng của dịch chiết cô đặc (8.5.2) sẽ được điều chỉnh để thu được tỷ lệ cuối cùng giữa khối lượng chiết cô đặc và khối lượng phần mẫu thử là từ 1 đến 5.

8.6  Bảo quản và các bước trước khi phát hiện

Nếu dịch chiết cô đặc (8.5.2) được phân tích trong vòng 48 h thì bảo quản dịch chiết ở 3 °C ± 2 °C hoặc 5 °C ± 3 °C (6.11). Nếu việc phát hiện không thể được thực hiện trong vòng 48 h thì bảo quản dịch chiết ở nhiệt độ ≤ -18 °C (6.11), trừ khi có quy định khác của nhà sản xuất bộ kit phát hiện được sử dụng.

Trong trường hợp dịch chiết đông lạnh, làm rã đông hoàn toàn và đồng hóa dịch chiết sử dụng máy Vortex trước khi thực hiện bước phát hiện.

Nếu xuất hiện bọt, đảm bảo rằng pipet ngập trong pha lỏng.

8.7  Phát hiện

Chọn bộ kit phát hiện đáp ứng các tiêu chí hiệu năng (độ đáp ứng, độ đặc hiệu, LOD₅₀) cho toàn bộ quy trình, được xác định trong tiêu chuẩn này (xem 8.8).

Thực hiện đúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với bước phát hiện của bộ kit được sử dụng.

8.8  Tiêu chí hiệu năng

Tiêu chí hiệu năng bao gồm độ đặc hiệu (SP, 3.2), độ đáp ứng (SE, 3.3), giới hạn phát hiện 50 % (LOD₅₀, 3.4) đã được xác định cho toàn bộ quy trình, bao gồm chiết xuất và phát hiện. Việc tính LOD₅₀ được thực hiện sử dụng chương trình chuyên dụng có sẵn trên mạng của ISO.

Các tiêu chí hiệu năng mà các bộ kit thương mại phải đạt được xác định như sau:

- SP và SE phải cao hơn 90 %.

- LOD₅₀ phải nhỏ hơn 0,06 ng SE/g. Giá trị này dựa trên BMD ước tính cho SEA là 6,1 ng và lượng tiêu thụ giả định là 100 g thực phẩm.

Vì dữ liệu tổng hợp chỉ có sẵn cho SEA, Staphylococcal enterotoxin thường gặp nhất liên quan đến SFPO, nên giá trị này được quyết định để sử dụng cho các kiểu loại độc tố khác từ SEB đến SEE^[4].

Các giá trị thu được từ các bộ kit phát hiện khác nhau và nền mẫu thực phẩm có và không có thẩm tách được nêu trong Điều 12. Các phòng thử nghiệm phải tham khảo dữ liệu thu được để thực hiện lựa chọn bộ kit phát hiện đáp ứng đầy đủ các tiêu chí nêu trên.

Dữ liệu được tóm tắt trong Phụ lục A và B đối với các nghiên cứu liên phòng được tổ chức năm 2013 và 2014, tương ứng. Các giá trị thu được từ các nghiên cứu liên phòng này có thể không áp dụng được cho các loại thực phẩm khác với các loại thực phẩm được nêu trong Phụ lục A và Phụ lục B.

9  Kiểm soát chất lượng

Nên kiểm tra toàn bộ quy trình bằng các chất chuẩn. Một ví dụ về chất chuẩn phù hợp được nêu trong Tài liệu tham khảo [5].

10  Biểu thị kết quả

Biểu thị các kết quả của phương pháp sàng lọc là:

- Staphylococcal enterotoxin SEA đến SEE được phát hiện trong x g phần mẫu thử, hoặc

- Staphylococcal enterotoxin SEA đến SEE không phát hiện được trong x g phần mẫu thử.

11  Khẳng định

Đối với các kết quả dương tính thu được có hoặc không có bước cô thẩm tách, nên phân tích mẫu liên quan về mục đích khẳng định, sử dụng phương pháp khác với phương pháp được quy định trong tiêu chuẩn này vì có thể xảy ra hiện tượng nhiễu (xem Phụ lục C).

12  Đặc tính hiệu năng của phương pháp

Các đặc tính hiệu năng của phương pháp đã được xác định trong các nghiên cứu liên phòng để đánh giá tính đặc hiệu, độ đáp ứng và LOD₅₀ của phương pháp.

Dữ liệu thu được về tính đặc hiệu, độ đáp ứng và LOD₅₀ được nêu trong các Bảng 1, 2 và 3, tương ứng.

Bảng 1 - Tính đặc hiệu (%) thu được bằng 3 bộ kít được thử nghiệm trên năm loại thực phẩm

Bảng 2 - Giá trị độ đáp ứng (%) thu được bằng 3 bộ kit được thử nghiệm trên năm loại thực phẩm

Bảng 3 - Giá trị LOD₅₀ (ng/g) thu được bằng 3 bộ kit được thử nghiệm trên năm loại thực phẩm

13  Báo cáo thử nghiệm

Phần diễn đạt sau đây có thể được sử dụng làm mẫu, với các nội dung bổ sung tùy theo từng trường hợp.

Báo cáo thử nghiệm phải chứa ít nhất các thông tin sau:

a) tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu được sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm được sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng: 2013

Một nghiên cứu liên phòng quốc tế gồm 21 cộng tác viên ở 17 quốc gia đã được thực hiện. Các loại thực phẩm đã được nghiên cứu: phomat tương ứng với loại sữa và sản phẩm sữa, thịt gia cầm tương ứng với loại thịt. Từng mẫu thực phẩm được thử nghiệm ở hai mức độ nhiễm khác nhau (L1 và L2), cộng với mẫu kiểm chứng âm tính (L0). Nghiên cứu được tổ chức vào năm 2013 bởi Phòng thử nghiệm chuẩn của Liên minh Châu Âu về CPS.

Sau nghiên cứu sơ bộ được tổ chức từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2013, ba bộ kit phát hiện (Ridascreen SET Total; Vidas SET2; Tecra Staph Enterotoxin VIA)1) trong số bảy bộ đã được thử nghiệm đã được lựa chọn dựa trên hiệu năng của chúng trên năm loại nền mẫu thực phẩm. Ba bộ kit được lựa chọn này đã được đánh giá trong nghiên cứu liên phòng năm 2013 trên hai nền mẫu thực phẩm được đề cập ở trên.

Số lượng mẻ sau đây được các phòng thử nghiệm tham gia sử dụng:

- Ridascreen SET Total: 12362

- Vidas SET2: 140412-0 và 140614-0

- Tecra Staph VIA: 12212012 và 16212084

Các giá trị của đặc tính hiệu năng thu được từ nghiên cứu liên phòng này được thể hiện cho mỗi loại mẫu trong Bảng A.1 đến A.9. Dữ liệu thu được từ một số cộng tác viên đã được loại trừ khỏi các tính toán trên cơ sở các lý do kỹ thuật xác định rõ ràng (ví dụ: sai lệch so với nguyên tắc).

Kết quả thu được trên sữa và các sản phẩm sữa (Bảng A, 1 đến A..3.) Chỉ đề cập đến bước cô thẩm tách vì bước này là bắt buộc trong Quy định EC 2073/2005 của EU được sửa đổi bởi EC 1441/2007 đối với các loại nền mẫu thực phẩm này.

Bảng A.1 – Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Ridascreen SET Total có cô thẩm tách trên mẫu phomat

Bảng A.2 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Tecra Staph VIA có cô thẩm tách trên mẫu phomat

Bảng A.3 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Vidas SET2 có cô thẩm tách trên mẫu phomat

Bảng A.4 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Ridascreen SET Total có cô thẩm tách trên mẫu thịt

Bảng A.5 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Ridascreen SET Total không cô thẩm tách trên mẫu thịt

Bảng A.6 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Tecra Staph VIA có cô thẩm tách trên mẫu thịt

Bảng A.7 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Tecra Staph VIA không cô thẩm tách trên mẫu thịt

Bảng A.8 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Vidas SET2 có cô thẩm tách trên mẫu thịt

Bảng A.9 – Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Vidas SET2 không cô thẩm tách trên mẫu thịt

Phụ lục B

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng: 2014

Một nghiên cứu liên phòng quốc tế gồm 33 cộng tác viên ở 20 quốc gia đã được thực hiện. Các loại thực phẩm đã được nghiên cứu: cá thu tương ứng với loại sản phẩm cá, quiche Lorraine tương ứng với loại thực phẩm ăn liền (RTE) và cream tráng miệng tương ứng với loại món tráng miệng. Từng mẫu thực phẩm được thử nghiệm ở hai mức độ nhiễm khác nhau (L1 và L2), cộng với kiểm chứng âm tính (L0). Nghiên cứu được tổ chức vào năm 2014 bởi Phòng thử nghiệm chuẩn của Liên minh Châu Âu về CPS.

Mục đích thứ hai của nghiên cứu liên phòng này là hoàn thành dữ liệu về ba loại thực phẩm còn lại được thử nghiệm cho ba bộ kit phát hiện (Ridascreen SET Total, Tecra staph VIA và Vidas SET2)2)

Số mẻ sau đây được các phòng thử nghiệm tham gia sử dụng:

- Ridascreen SET Total: 14393

- Tecra Staph VIA: 16213010

- Vidas SET2: 140902-0

Các giá trị của đặc tính hiệu năng thu được từ nghiên cứu liên phòng này được thể hiện cho mỗi loại mẫu trong Bảng B.1 đến B.9.

Bảng B.1 đến B.3 tương ứng với loại sản phẩm cá có và không có bước cô thẩm tách.

Bảng B.4 đến B.6 tương ứng với loại RTE có và không có bước cô thẩm tách.

Bảng B.7 đến B.9 tương ứng với loại món tráng miệng có và không có bước cô thẩm tách.

Dữ liệu thu được từ một số cộng tác viên đã được loại trừ khỏi các tính toán trên cơ sở các lý do kỹ thuật xác định rõ ràng (ví dụ: sai lệch so với nguyên tắc).

Bảng B.1 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Ridascreen SET Total trên các mẫu cá có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.2 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Tecra Staph VIA trên các mẫu cá có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.3 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Vidas SET2 trên các mẫu cá có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.4 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Ridascreen SET Total trên các mẫu RTE có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.5 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Tecra Staph VIA trên các mẫu RTE có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.6 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Vidas SET2 trên các mẫu RTE có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.7 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Ridascreen SET Total trên các mẫu món tráng miệng có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.8 – Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Tecra Staph VIA trên các mẫu món tráng miệng có và không có bước cô thẩm tách

Bảng B.9 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được bằng Vidas SET2 trên các mẫu món tráng miệng có và không có bước cô thẩm tách

Phụ lục C

(Tham khảo)

Lưu ý về các chất gây nhiễu

C.1  Việc phát hiện miễn dịch các loại Staphylococcal enterotoxin trong nền mẫu thực phẩm có một số nhược điểm. Phản ứng SE không đặc hiệu với một số bộ kit có bán sẵn trong thương mại đã được báo cáo trước đây với các loại thực phẩm khác nhau hoặc với thực phẩm bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác ngoài Staphylococcus spp. Một số nhiễu có thể do các enzym nội sinh như lactoperoxidase (xem C.3) hoặc phosphatase kiềm từ sữa tươi nguyên liệu (xem C.2).

C.2  Phosphatase kiềm thường có trong các loại phomat được làm từ sữa tươi nguyên liệu.

Trong trường hợp kết quả dương tính với bộ kit phát hiện sử dụng phosphatase kiềm làm enzym (ví dụ: Vidas SET2) và nếu nghi ngờ có nhiễu:

a) cho 600 μl lượng dịch chiết cô đặc đã xử lý vào một ống nghiệm;

b) thực hiện xử lý nhiệt ở 80 °C trong hai phút (để phá hủy phosphatase kiềm),

c) sau khi làm mát, tiến hành phát hiện sử dụng bộ kit phát hiện Vidas SET2.

Vì việc xử lý nhiệt này có thể làm mất hoạt tính huyết thanh của các loại độc tố có trong dịch chiết cô đặc, nên không được thực hiện trước bước phát hiện do kết quả có thể bị âm tính giả.

Tuy nhiên, trong trường hợp kết quả dương tính thu được từ bộ kit phát hiện Vidas SET2 và nếu nghi ngờ có nhiễu, có thể áp dụng quy trình như vậy.

Trong trường hợp nghi ngờ có nhiễu với bộ kit Vidas SET2, thực hiện nếu có thể một bộ kit phát hiện khác sử dụng enzym khác để phát hiện (ví dụ: lactoperoxidase được sử dụng trong bộ kit Ridascreen SET Total).

C.3  Lactoperoxidase bền với pH 3 và khối lượng phân tử của nó có thể giải thích thực tế là không bị phá hủy hoặc bất hoạt trong bước chiết.

Trong trường hợp kết quả dương tính thu được từ một bộ kit phát hiện sử dụng lactoperoxidase làm enzym (ví dụ: Ridascreen SET Total) và nếu nghi ngờ có nhiễu do lactoperoxidase nội sinh, có thể thực hiện phép thử như sau:

a) cho 100 μl dịch chiết cô đặc đã xử lý vào một ống nghiệm và thêm 50 μl cơ chất và 50 μl dung dịch crom từ bộ kit phát hiện Ridascreen SET Total;

b) nếu xuất hiện màu xanh lục lam, lactoperoxidase nội sinh có trong dịch chiết cô đặc và có thể giải thích kết quả dương tính giả thu được bằng phương pháp sàng lọc.

Nếu nghi ngờ có nhiễu với bộ kit phát hiện Ridascreen SET Total thì thực hiện bằng một bộ kit sử dụng enzym khác, nếu có thể.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] J.-A. Hennekinne, M.-L. De Buyser, S. Dragacci Staphylococcus aureus and its food-poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol. Rev. 2012, 36 pp. 815-836

[2] COMMISSION REGULATION (EC) No. 1441/2007 of 5 December 2007 amending Regulation (EC) No. 2073/2005 on microbiological criteria for foodstuffs. Off J. Eur. Union. 2007, L322 pp. 12-29

[3] L. Guillier, H. Bergis, F. Guillier, V. Noel, F. Auvray, J.A. Hennekinne Dose-response modelling of Staphylococcal enterotoxins using outbreak data. Procedia Food Sci. 2016, 7 pp. 129-132

[4] J.-A. Davis, J.-S. Gift, Q.-J. Zhao Introduction to benchmark dose methods and US EPA’s benchmark dose software (BMDS) version 2.1.1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2011, 254 pp. 181-191

[5] R. Zeleny, Y. Nia, H. Schimmel, I. Mutel, J.-A. Hennekinne, H Emteborg, J Charoud-Got, F Auvray Certified reference materials for testing of the presence/absence of Staphylococcus aureus enterotoxin A (SEA) in cheese. Anal. Biochem. 2016, 408 pp. 5457-5465