Tiêu chuẩn TCVN 8545:2010 Xác định monensin, narasin và salinomycin trong thức ăn chăn nuôi

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8545:2010

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN, NARASIN VÀ SALINOMYCIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG VỚI DẪN XUẤT SAU CỘT

Animal feeding stuffs – Determination of monensin, narasin and salinomycin contents – Liquid chromatographic method using post-column derivatization

Lời nói đầu

TCVN 8545:2010 hoàn toàn tương đương với ISO 14183:2005;

TCVN 8545:2010 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN, NARASIN VÀ SALINOMYCIN – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG VỚI DẪN XUẤT SAU CỘT

Animal feeding stuffs – Determination of monensin, narasin and salinomycin contents – Liquid chromatographic method using post-column derivatization

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng monensin, narasin và salinomycin trong thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu bổ sung (dạng khô và lỏng) và các premix khoáng. Phương pháp này không áp dụng đối với các premix thuốc (dược phẩm). Phương pháp này không áp dụng để xác định lasalocid và semduramicin.

Giới hạn định lượng đối với monensin, narasin và salinomycin tương ứng khoảng 1mg/kg, 2mg/kg và 2 mg/kg. Giới hạn định lượng thấp hơn cũng có thể đạt được nhưng phải được thẩm định bởi người sử dụng.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.

3. Nguyên tắc

Các thể mang ion (ionophore) monensin, narasin và salinomycin được chiết với hỗn hợp metanol/nước (90 + 10) bằng máy lắc trong 1 h, sau đó dịch chiết được lọc. Các thể mang ion được xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo sử dụng dẫn xuất sau cột với vanilin và phát hiện ở bước sóng 520 mm. Các mẫu dương tính nghi ngờ ở mức vết và các mẫu thức ăn chăn nuôi bổ sung thuốc thú y có chứa các thể mang ion không dự kiến được khẳng định bằng cách chiết với hexan hoặc tạo dẫn xuất sau cột với dimetylaminobenzaldehyt (DMAB).

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1. Nước, loại dùng cho HPLC hoặc tương đương (ví dụ nước siêu sạch Milli-Q).

4.2. Metanol (CH₃OH), loại dùng cho HPLC.

4.3. Axit sulfuric (H₂SO₄), 97 % đến 98 %.

4.4. Axit axetic (CH₃COOH) băng, 97 % đến 98 %.

4.5. Natri hydrocacbonat (NAHCO₃), độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.6. Vanilin (4-hydroxy-3-metoxybenzaldehyt), độ tinh khiết tối thiểu 99 %.

4.7. Dimetylaminobenzaldehyt (DMAB), độ tinh khiết tối thiểu 99 %

4.8. Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃], được cất bằng dụng cụ thủy tinh.

4.9. Dung môi chiết, metanol/nước (90 + 10).

Trộn 1 800 ml metanol (4.2) và 200 ml nước (4.1) trong bình 2 lít, trộn đều.

4.10. Pha động

4.10.1. Hệ thống phản ứng sau cột

Vừa khuấy và thêm từ từ bằng pipet 20 ml axit sulfuric (4.3) vào 950 ml metanol (4.2). Để nguội, vừa khuấy vừa thêm 30 g vanilin (4.6). Bảo quản tránh ánh sáng. Chuẩn bị mới trong ngày sử dụng.

4.10.2. Cột HPLC

Hỗn hợp metanol (4.2)/nước (4.1)/axit axetic (4.4) (940 : 60 : 1). Lọc bằng chân không với hệ thống nêu trong 5.7.

4.11. Metanol trung tính

Thêm 1,0 g natri hydrocacbonat (4.5) vào 4 lít metanol (4.2). Trộn đều và lọc qua giấy lọc 11mm, nếu cần (ví dụ giấy lọc Whatman No.1)[1]. Xem Chú thích ở 4.13.

4.12. Chất chuẩn

Thành phần hoặc nồng độ của từng lô chất chuẩn cần được biết.

4.12.1. Natri monensin[2]

4.12.2. Narasin²

4.12.3. Natri salinomycin[3]

CẢNH BÁO: Tránh bị hít vào hoặc tiếp xúc với các chất chuẩn và dung dịch chuẩn có độc tính. Luôn làm việc trong tủ hút khói khi xử lí các loại dung môi và dung dịch thuốc thử. Mang kính an toàn và quần áo bảo hộ.

4.13. Các dung dịch chuẩn gốc ionophore, khoảng 0,50 mg/ml.

Cân 25 mg mỗi loại chất chuẩn (từ 4.12.1 đến 4.12.3), chính xác đến 0,1 mg, vào các bình định mức 50 ml. Hòa tan bằng metanol trung tính (4.11) và định mức đến vạch. Chuẩn bị mới dung dịch chuẩn gốc hàng tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.

Bảo quản các dung dịch chuẩn tránh sáng hoặc chuẩn bị trong các bình thủy tinh sẫm màu.

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng metanol trung tính chưa được xác nhận đối với salinomycin. Nếu chỉ phân tích riêng monensin thì không yêu cầu, nhưng là bắt buộc nếu phân tích narasin.

4.13.1. Dung dịch chuẩn gốc monensin

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc monensin theo 4.13. Tính nồng độ dung dịch chuẩn gốc dựa vào thành phần chính monensin A. Thành phần phụ monensin B trong mẫu thử, được rửa giải ngay trước khi rửa giải monensin A ^[4], được xác định dựa vào monensin A. Sử dụng thành phần đã nhận biết của chuẩn dựa theo chứng chỉ kèm theo và tính theo công thức:

p_M =

Trong đó:

0,5 là nồng độ của dung dịch chuẩn gốc (4.13), tính bằng miligam trên mililít (mg/ml), được xác định đến ba chữ số có nghĩa;

 là nồng độ của monensin A trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililít (mg/ml);

 là tỉ lệ của monensin A trong chất chuẩn đối chứng nêu trong chứng chỉ kèm theo, tính bằng phần trăm (%).

VÍ DỤ Lô chất chuẩn RS0234 chứa 93,71 % monensin A, tính theo khối lượng.

4.13.2. Dung dịch chuẩn gốc salinomycin

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo 4.13. Tính nồng độ chuẩn gốc dựa vào nồng độ của chuẩn đối chứng của nhà cung cấp đưa ra ^[2]:

Trong đó:

 là nồng độ của salinomycin trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililit (mg/ml);

w là hàm lượng của chất chuẩn salinomycin do nhà cung cấp đưa ra, tính bằng microgam trên miligam ().

VÍ DỤ Đối với lô WS-19B, hàm lượng chất chuẩn là 986 mg/mg

4.13.3. Dung dịch chuẩn gốc narasin

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo 4.13. Tính nồng độ chuẩn gốc dựa vào thành phần chính là narasin A. Những thành phần phụ (narasin D và l), được rửa giải sau narasin A ^[5], được xác định dựa vào chuẩn narasin A. Sử dụng thành phần của chuẩn đã biết dựa vào chứng chỉ kèm theo và tính theo công thức.

Trong đó:

P_N là nồng độ của narasin A trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng miligam trên mililít (mg/ml);

S_N là tỉ lệ của narasin A trong chất chuẩn đối chứng nêu trong chứng chỉ kèm theo, tính bằng phần trăm (%).

VÍ DỤ Đối với lô chất chuẩn RS0234, tỷ lệ phần trăm mỗi thành phần tính theo khối lượng là:

Narasin A = 85,4 %

Narasin D = 1,9 %

Narasin l = 0,7 %

4.14. Dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian, chứa monensin, salinomycin và narasin tương ứng khoảng 20mg/ml, 40  và 40 .

Dùng pipet lấy 10,0 ml, 20,0 ml và 20,0 ml các dung dịch chuẩn gốc monensin, salinomycin và narasin (4.13) tương ứng cho vào bình định mức 250 ml. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng.

4.15. Dung dịch hỗn hợp chuẩn cho HPLC

Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch hỗn hợp chuẩn HPLC bằng cách dùng pipet lấy các thể tích hỗn hợp chuẩn trung gian (4.14) vào bình định mức sẫm màu dung tích 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9), như quy định trong Bảng 1. Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng.

Bảng 1

4.16. Các chuẩn riêng rẽ dùng cho HPLC

4.16.1. Monensin, khoảng 5.

Dùng pipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc monensin (4.13.1) vào bình định mức 100ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.

4.16.2. Salinomycin, khoảng 10.

Dùng pipet lấy chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc salinomycin (4.13.2) vào bình định mức 100ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.

4.16.3. Narasin, khoảng 10

Dùng pipet lấy chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc narasin (4.13.3) vào bình định mức 100 ml sẫm màu. Pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.9). Trộn đều. Chuẩn bị dung dịch để sử dụng trong tháng. Bảo quản trong tủ lạnh.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể sau:

5.1. Hệ thống HPLC, bao gồm các bộ phận sau:

5.1.1. Bơm, đã khử xung, tốc độ dòng từ 0,1ml/min đến 2,0 ml/min.

5.1.2. Bộ phận bơm mẫu, bằng tay hoặc tự động, có khả năng bơm 100 mẫu.

5.1.3. Detector UV/VIS, có bước sóng thay đổi, có thể đo ở bước sóng 520 nm và 592 nm.

5.1.4. Bộ tích phân, hoặc máy tính xử lí dữ liệu.

5.1.5. Bộ phận phản ứng sau cột, với cuộn dây phản ứng dung tích từ 1,5 ml đến 2,0 ml, có thể gia nhiệt ở 98 ^oC.

Cuộn dây phản ứng có thể mua sẵn hoặc làm bằng ống loại 316 SS, đường kính trong 0,5 mm, chiều dài từ 7,5 m đến 10 m, cuộn lại cho vừa với buồng gia nhiệt. Ví dụ, có thể cuộn ống phản ứng trong giấy nhôm để vừa khít vào bộ phận gia nhiệt và truyền nhiệt tốt. Loại cuộn dây chế tạo sẵn thường được ưa dùng. Để đảm bảo các loại thuốc thử trộn lẫn tốt với nhau, sử dụng máy lắc trộn hoặc đầu nối trộn tĩnh (không phải dạng nối trộn thông thường) phía trước cuộn dây phản ứng.

5.1.6. Bơm thuốc thử sau cột, đã khử xung, với tốc độ từ 0,5ml/min đến 2,0 ml/min.

5.1.7. Cột phân tích.

CHÚ THÍCH: Các loại cột C18 5mm, Nucleosil 120A 25 x 0,46 cm, Partisil 5 ODS-3 hoặc Waters Nova Pak (4mm) hoặc tương đương đã được đánh giá là phù hợp[4].

5.1.8. Cột bảo vệ, C18.

5.2. Thiết bị thổi khí bằng nitơ, dùng để thổi dung môi sử dụng dòng khi nitơ.

5.3. Máy lắc, dạng tròn hoặc dạng xoắn.

5.4. Cân: Cân phân tích có thể cân 10 g hoặc lớn hơn với độ chính xác 0,1 mg và cân có thể cân 100 g hoặc lớn hơn với độ chính xác 0,01 g.

5.5. Bình nón, dung tích 125 ml, 250 ml và 500 ml, có nắp bằng thủy tinh.

5.6. Giấy lọc, Whatman No. 41 (15 cm), Whatman No. 42 (15 cm) và Whatman No. 1 (15 cm) hoặc tương đương ⁴.

5.7. Bộ lọc dung môi, hoàn toàn bằng thủy tinh, dùng cho màng lọc 47 mm và màng lọc nylon 47 mm, cỡ lỗ 0,45

5.8. Bộ lọc mẫu, thiết bị dùng màng lọc nylon hoặc PTFE có cỡ lỗ 0,45

5.9. Rây, cỡ lỗ lỗ 1 mm.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497).

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498).

Nghiền mẫu phòng thử nghiệm (> 200 g) để lọt qua rây có cỡ lỗ 1 mm. Đối với các mẫu có lượng vết thì nghiền toàn bộ mẫu thử. Trộn kĩ.

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng

Nên sử dụng các mẫu kiểm soát chất lượng và các biểu đồ kiểm soát chất lượng.

Với mỗi dãy, thêm một mẫu bổ sung chuẩn có hàm lượng monensin, salinomycin và narasin tương ứng khoảng 100 mg/kg, 50 mg/kg và 50 mg/kg (đối với mẫu bổ sung thuốc thú y) hoặc với 4 mg/kg, 6 mg/kg và 6 mg/kg (đối với mẫu có dạng vết).

VÍ DỤ 1 Thêm 4,0 ml chuẩn gốc monensin vào 20 g mẫu để có mẫu bổ sung chuẩn 100 mg/kg và thêm 2,0 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc salinomycin và narasin vào 20 g mẫu bổ sung chuẩn 50mg/kg mỗi loại. Tất cả dung dịch gốc có nồng độ xấp xỉ như nhau (0,50 mg/ml, xem 4.13).

VÍ DỤ 2: Thêm 3,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian (4.14) vào 20 g mẫu để có mẫu bổ sung chuẩn 3 mg/kg đối với monensin và 6 mg/kg đối với salinomycin và narasin.

Độ thu hồi đối với mẫu bổ sung thuốc thú y (> 10 mg/kg) phải nằm trong khoảng từ 95 % đến 108%. Độ thu hồi đối với mẫu dạng vết (< 10 mg/kg) phải nằm trong khoảng từ 90 % đến 110 %.

8.2. Chiết mẫu

8.2.1. Mẫu thức ăn chăn nuôi khô và các premix chứa < 5000 mg/kg

Cân chính xác 20 g mẫu thử vào bình nón 250 ml. Đối với các premix khoáng, thêm 5 g natri hydrocacbonat. Thêm 100 ml dung môi chiết (4.9). Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc (5.3).

8.2.2. Mẫu thức ăn chăn nuôi khô và các premix chứa > 5000 mg/kg

Cân chính xác 5 g mẫu vào bình nón 500 ml. Đối với mẫu premix khoáng, thêm 2 g natri hydrocacbonat. Thêm 200 ml dung môi chiết (4.9). Đậy nắp và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc (5.3).

8.2.3. Mẫu dạng lỏng

Đồng hóa mẫu bằng cách khuấy mẫu trên máy khuấy từ hoặc máy khuấy trộn. Lấy 20 ml mẫu dạng lỏng cho vào một ống đong chia độ 25 ml đã biết khối lượng. Cân và chuyển mẫu vào bình nón 500 ml. Thêm 180 ml metanol (4.2) (dùng một ít để tráng ống đong). Đậy nắp bình nón và lắc mạnh trong 1 h bằng máy lắc (5.3).

8.2.4. Lọc dịch chiết

Lọc dịch chiết qua giấy lọc Whatman No.41 (5.6) vào một bình nón 125 ml.

Đối với dịch chiết có nồng độ kháng sinh ionophore cao, pha loãng đến nồng độ tương đương với chuẩn D cho HPLC (4.15). Hệ số pha loãng D có thể được tính theo công thức sau:

D =

Trong đó:

W_s là nồng độ kháng sinh trong mẫu, tính bằng kilogam trên mililít (mg/kg);

P_std là nồng độ của chuẩn dùng cho HPLC, tính bằng microgam trên mililít ();

m_t là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V_e là thể tích dịch chiết, tính bằng mililít (ml).

Lọc dịch chiết nói trên hoặc rửa giải qua màng lọc 0,45 mm trước khi phân tích trên HPLC.

8.3. Phân tích HPLC

8.3.1. Điều kiện sắc kí

a) Các thông số phân tách bằng HPLC

b) Điều kiện phản ứng sau cột:

Cần đáp ứng các tiêu chí về sự phù hợp của hệ thống theo 8.3.2. Cả ba chất chuẩn ionophore và các thành phần phụ phải được phân giải tốt trong điều kiện sắc kí, tuy nhiên, thành phần phụ của salinomycin có thể xuất hiện như một pic biên đứng phía trước pic narasin. Sử dụng cột Nucleosil (5.1.7) với các điều kiện như trên, thời gian lưu tương ứng đối với monensin B, monensin A, salinomycin, narasin A và narasin (D + l) phải xấp xỉ 8,7 min, 9,8 min, 11,2 min, 12,8min và 14,6 min.

Tốc độ dòng và pha động đối với cột phân tích có thể dao động nhẹ, tuy nhiên tổng tốc độ dòng phải nằm trong khoảng từ 1,5 ml/min đến 1,6 ml/min để cho phép thời gian phản ứng ít nhất là 1min. Độ nhạy được xác định bởi các điều kiện phản ứng và tín hiệu detecor/nhiễu.

Maduramicin là một chất cản trở chính khi mẫu phân tích có dạng vết đối với salinomycin; maduramicin được rửa giải khoảng 0,3 min trước salinomycin. Semduramicin là chất cản trở chính khi phân tích monensin; nó được rửa giải khoảng 0,4 min trước monensin B. Cả maduramicin và semduramicin cho thấy độ nhạy thấp và có thể xử lí hiệu quả bằng quy trình khẳng định trong Điều 9.

8.3.2. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống

8.3.2.1. Độ phân giải

Bơm hỗn hợp chuẩn D dùng cho HPLC (4.15).

Tính hệ số phân giải F_R đối với các cặp pic cạnh nhau như sau:

F_R =2

Trong đó:

d_n là khoảng cách trên đường nền giữa điểm bắt đầu của sắc đồ và cực đại của pic, tính bằng centimet (cm);

w_n là độ rộng pic trên đường nền, tính bằng centimet (cm);

n là số của pic (n=1 hoặc 2).

VÍ DỤ Dữ liệu để tính độ phân giải giữa monensin B (1) và monensin A (2):

d₁ = 10,38 cm, w₁ = 0,46 cm;

d₂ = 11,98 cm, w₂ = 0,52 cm;

F_R =2= 3,3

Giá trị F_R phải lớn hơn 1,4 đối với tất cả các cặp pic cạnh nhau. Nếu tiêu chí này không được đáp ứng, điều chỉnh các điều kiện HPLC để cải thiện độ phân giải, sau đó lặp lại việc bơm chuẩn và tính.

8.3.2.2. Hệ số đuôi pic

Tính hệ số đuôi pic F_T theo công thức sau:

F_T =

Trong đó:

t là thời gian lưu của pic (thời gian cực đại của đường cong Gauss), tính bằng phút (min);

t_a là thời gian lưu khi pic đạt độ cao bằng 5 % của cực đại pic;

t_b là thời gian lưu khi pic đi xuống và đạt độ cao bằng 5 % của cực đại pic;

Hệ số đuôi pic F_T đối với monensin A, salinomycin và narasin phải nhỏ hơn 1,4.

8.4. Xác định

8.4.1. Bơm lặp lại 100 hỗn hợp chuẩn D dùng cho HPLC (4.15) hoặc các chuẩn đơn (4.16) thích hợp đến khi độ lặp lại của diện tích pic nằm trong khoảng ± 1 % và đường nền ổn định. Bơm 5 mỗi dung dịch chuẩn gốc nếu cần để định tính tất cả các pic. Kiểm tra độ tuyến tính bằng cách bơm 100  mỗi dung dịch chuẩn HPLC hỗn hợp A, B, C, D và E (4.15). Đường chuẩn hồi quy tuyến tính (hệ số tương quan không nhỏ hơn 0,999) và điểm cắt trục tung cách giao điểm zero không đáng kể.

Việc định lượng có thể thực hiện bằng cách sử dụng một điểm chuẩn hoặc một đường chuẩn. Cách sử dụng đường chuẩn thường được sử dụng nhiều hơn.

Đối với việc định lượng bằng một điểm chuẩn, khi phân tích mẫu bổ sung thuốc thú y cần sử dụng chuẩn đơn thích hợp (4.16) (chỉ dùng hỗn hợp chuẩn khi phân tích nhiều loại ionophore). Đối với mẫu thử dạng vết, dùng hỗn hợp chuẩn B dùng cho HPLC (4.15) để định lượng. Bơm lại dung dịch chuẩn sau 8 đến 10 lần bơm dung dịch mẫu thử.

Đối với việc định lượng bằng đường chuẩn, bơm dãy chuẩn HPLC (4.15) lúc ban đầu và kết thúc phân tích mẫu. Dựng đường chuẩn hồi quy tuyến tính.

Bơm 100  dung dịch mẫu thử. Xác định diện tích pic. Nếu diện tích pic lớn hơn pic chuẩn đơn hoặc nằm ngoài dãy chuẩn thì pha loãng dung dịch mẫu thử bằng dung môi chiết (4.9). Không giảm thể tích mẫu bơm vào.

CHÚ THÍCH: Do dung dịch mẫu thử không được làm sạch nên thời gian lưu có thể dài hơn đến 0,5 min so với thời gian lưu của pic chuẩn. Điều này chủ yếu xảy ra đối với monensin. Tuy nhiên, sự có mặt có pic monensin B thường khẳng định sự có mặt của monensin. Nếu có nghi ngờ, có thể định tính pic bằng cách thêm chuẩn vào dung dịch mẫu thử hoặc khẳng định bằng thuốc thử DMAB (9.2) hoặc chiết bằng hexan (9.3).

8.4.2. Trình tự tắt hệ thống như sau: tắt bơm thuốc thử sau cột trước khi tắt bơm dung môi HPLC để đề phòng dòng thuốc thử sau cột chạy ngược vào cột sắc kí. Rửa cột và bộ phận phản ứng 30 min đến 45 min bằng metanol (4.2).

9. Khẳng định bằng HPLC

9.1. Yêu cầu chung

Các mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y có chứa các ionophore không dự kiến cần được khẳng định để xác nhận việc nhận biết chính xác các pic. Có thể áp dụng một trong hai quy trình sau đây, tuy nhiên quy trình dùng thuốc thử DMAB là tốt nhất. Việc chiết bằng hexan không thể áp dụng đối với các mẫu premix khoáng hoặc mẫu dạng lỏng và các kết quả khi sử dụng hexan ít có giá trị định lượng (chỉ khoảng 90 %), nhưng với mẫu phức tạp thì sắc đồ được cải thiện đáng kể (ít các pic nhiễu). Xem 10.5 về cách diễn giải các kết quả.

9.2. Dẫn xuất sau cột bằng DMAB

Quy trình này có thể áp dụng cho tất cả các loại mẫu thức ăn chăn nuôi ^[6].

Tiến hành các bước từ 8.1 đến 8.4 và các điều kiện HPLC (8.3.1), nhưng sử dụng các thông số phản ứng sau cột như sau:

a) Thông số phản ứng sau cột:

b) Thuốc thử sau cột (pha động):

- vừa khuấy nhẹ vừa thêm 20 ml axit sulfuric (4.3) vào 950 ml metanol (4.2)

- để nguội, vừa khuấy vừa thêm 30 g DMAB (4.7)

- tránh ánh sáng, chuẩn bị mới trong ngày sử dụng.

9.3. Chiết bằng hexan

Quy trình này không áp dụng đối với mẫu chứa khoáng hoặc mẫu dạng lỏng.

Cân chính xác 20 g mẫu vào bình nón 250 ml. Thêm 100 ml hexan (4.8). Đậy nắp và lắc qua đêm bằng máy lắc (5.3). Lọc dung dịch mẫu qua giấy lọc Whatman No. 42 (5.6) vào bình nón 125 ml. Dùng pipet lấy 10 ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho bay hơi đến khô sử dụng thiết bị thổi khí bằng nitơ (5.2). Hòa tan phần còn lại trong 10 ml dung môi chiết (4.9). Lọc dịch chiết trước khi tiến hành phân tích bằng HPLC (8.3).

10. Tính kết quả

10.1. Yêu cầu chung

Tính hàm lượng ionophore trong mẫu bằng cách so sánh diện tích pic của mỗi mẫu với diện tích pic trung bình của dung dịch chất chuẩn trước và sau khi bơm mẫu (phương pháp một điểm chuẩn). Đối với monensin và narasin thì các kết quả được tính theo hoạt tính kháng khuẩn bằng cách dùng các hệ số hiệu quả sinh học. Kết quả đối với salinomycin được biểu thị theo tỉ lệ khối lượng.

10.2. Monensin

Hàm lượng monensin (mg/kg) tương đương với giá trị sinh học của monensin A + B.

Giá trị sinh học, B, của mỗi thành phần, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

B_M =

Trong đó:

A_M là diện tích pic thu được của monensin A hoặc B trong dung dịch mẫu thử;

A_AS là diện tích pic của monensin A trong dung dịch chuẩn (trung bình);

p_AS là nồng độ của monensin A trong dung dịch chuẩn tính bằng microgam trên mililit ();

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích dịch chiết hoặc tổng thể tích mẫu (đối với mẫu dạng lỏng), tính bằng mililit (ml);

D là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);

F_M là hệ số hiệu quả sinh học của thành phần đã biết (monensin A hoặc B), thể hiện mối tương quan giữa giá trị HPLC với hoạt tính kháng khuẩn:

F­_A = 1,00

F_B = 0,28

Hoạt tính tổng số của monensin bằng B_A+ B_B, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg).

Để tính độ thu hồi của monensin trong mẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số F_M trong công thức.

Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được monensin B.

Nồng độ của monensin B trong dung dịch thử được tính theo chuẩn monensin A. Xem ví dụ cụ thể và cách tính.

VÍ DỤ:

B_A  = mg/kg

B_B =   mg/kg

Tổng hàm lượng monensin = 99,0 + 1,3 = 100,3 mg/kg

10.3. Salinomycin

Hàm lượng salinomycin trong mẫu, w_s, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

w_s =

hoặc:

w_s = p_t x

Trong đó:

A là diện tích pic của salinomycin trong dung dịch mẫu thử.

A_s là diện tích pic của salinomycin trong dung dịch chuẩn HPLC (trung bình);

P_s là nồng độ chuẩn salinomycin trong dung dịch chuẩn HPLC, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

m_t  là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích chiết, tính bằng mililit (ml);

D là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);

p_t là nồng độ salinomycin trong dung dịch mẫu thử xác định từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (mg/l).

VÍ DỤ:

w_s = mg/kg

10.4. Narasin

Hàm lượng narasin (mg/kg) tương đương với giá trị sinh học của narasin [A + (D + l)].

Giá trị sinh học của mỗi thành phần, B, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

B_N =

hoặc:

B_N = p_N x

Trong đó:

A_N là diện tích pic thu được của narasin A hoặc (D+l) trong dung dịch mẫu thử;

A_AS là diện tích pic của narasin A trong dung dịch chuẩn (trung bình);

p_AS là nồng độ của narasin A trong dung dịch chuẩn, tính bằng tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

m_t  là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích dung môi, tính bằng mililit (ml);

D là hệ số pha loãng (xem 8.2.4 và 8.4.1);

F_N là hệ số hiệu quả sinh học của narasin [A hoặc (D + l)];

p_N  là nồng độ narasin trong dung dịch mẫu thử tính từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

F_A = 1,077

F_D+l được tính theo công thức sau:

F_(D+l)  =

Trong đó:

c_Ds là hàm lượng narasin D trong chuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);

c_is là hàm lượng narasin l trong chuẩn narasin, tính bằng phần trăm (%);

và hệ số hiệu quả sinh học đối với từng đồng phân là:

F_D = 1,510;

F_l = 0,012.

Xem phần Hồ sơ chất chuẩn đối chứng về phần trăm của các đồng phân A, D và l trong chuẩn đối chứng sử dụng.

Nồng độ của các đồng phân (D + l) trong dịch chiết mẫu được tính theo đồng phân A trong dung dịch chuẩn. Xem ví dụ về cách tính.

VÍ DỤ 1: Đối với lô chuẩn đối chứng RS0302, c_Ds = 1,9 % và c_is = 0,7 %

F_D+l =

Để tính tỷ lệ phần trăm thu hồi của narasin trong mẫu bổ sung chuẩn, không sử dụng hệ số F_n trong công thức tính. Đối với mẫu dạng vết, có thể không xác định được narasin (D + l).

VÍ DỤ 2

B_N = mg/kg

B_N  =  mg/kg

Hàm lượng narasin tổng số = 56,3 + 2,9 = 59,2 mg/kg

Báo cáo các kết quả cuối cùng đến hai chữ số có nghĩa nếu < 10 mg/kg và đến ba chữ số có nghĩa nếu > 10 mg/kg. Các mẫu thử dương tính ở mức vết và các mẫu bổ sung thuốc thú y nghi ngờ có chứa các ionophore không dự kiến cần được khẳng định. Xem Điều 9.

10.5. Diễn giải kết quả khẳng định mẫu dương tính

Khi khẳng định bằng cách dùng DMAB làm thuốc thử sau cột, các kết quả đối với các ionophore phải phù hợp với những kết quả thu được khi dùng vanilin. Tuy nhiên, kích cỡ pic của từng ionophore khi dùng DMAB phải lớn hơn 1,3 lần đến 1,5 lần so với kết quả thu được khi dùng vanilin. Tỷ lệ cỡ pic đối với DMAB/vanilin đối với mẫu thử phải phù hợp với chất chuẩn.

Nếu nghi ngờ có maduramicin ở thời gian lưu giống với salinomycin thì kết quả thu được sử dụng DMAB phải thấp hơn đáng kể vì maduramicin kém nhạy hơn salinomycin khoảng 6 lần. Một mẫu chứa maduramicin với hàm lượng 5 mg/kg sẽ cho một pic có tín hiệu tương đương với mẫu chứa salinomycin với hàm lượng 1 mg/kg; nghĩa là thấp hơn giới hạn định lượng salinomycin.

Nếu có mặt semduramicin thì phải có một pic ngay trước monensin B. Khi dùng vanilin để khẳng định thì semduramicin kém nhạy hơn khoảng 13 lần so với cả monensin A và B. Khi dùng DMAB thì semduramicin kém nhạy hơn monensin khoảng 28 lần.

Khi khẳng định bằng cách chiết với hexan, các kết quả đối với ba loại ionophore chỉ được sai lệch trong vòng 10 % so với kết quả khi chiết bằng metanol 90 %. Nếu có mặt maduramicin hoặc semduramicin, phương pháp chiết bằng hexan cho kết quả từ 40 % đến 50 % so với kết quả thu được khi chiết bằng metanol.

Các thông tin nói trên cần được thẩm định lại đối với mỗi hệ thống HPLC cụ thể.

Việc định tính pic được khẳng định bằng quy trình ở Điều 8 nếu thời gian lưu của chuẩn và mẫu khác nhau không quá 0,2 min và kết quả định lượng nằm trong khoảng ± 5 % (vanilin so với DMAB) và ± 10 % (chiết bằng 90 % metanol so với chiết bằng hexan).

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Chi tiết về phép thử liên phòng nghiệm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác.

11.2. Độ lặp lại

Chêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ lặp lại (r) thu được bằng công thức sau ⁽⁹⁾;

r = 2 x 2^1/2 x RSD(r) = 2,8 x RSD (r)

trong đó RSD(r) là độ lệch chuẩn tương đối lặp lại.

Các giá trị độ lặp lại giống nhau đối với cả 3 chất phân tích, xem ở Bảng 2.

11.3. Độ tái lập

Chêch lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ, biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn giới hạn độ tái lập (R) thu được bằng công thức sau ^[9];

R= 2,8 x RSD(R)

Trong đó RSD(R) là độ lệch chuẩn tương đối tái lập.

Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập đối với mẫu bổ sung thuốc thú y (> 10 mg/kg), chế phẩm bổ sung và các premix khoáng chất theo các bảng A.1, A.2 và A.3, được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2

Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập tương tự cũng thu được ở mẫu thức ăn chăn nuôi dạng vết, trừ các mẫu chứa hàm lượng monensin 3 mg/kg (có thể do mẫu kém đồng nhất).

11.4. Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng thực nghiệm là 1 mg/kg đối với monensin và 2 mg/kg đối với narasin và salinomycin. Có thể đạt được giới hạn định lượng thấp hơn tùy thuộc hệ thống HPLC được sử dụng và phải được người sử dụng phương pháp đánh giá hiệu lực.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

- phương pháp thử đã dùng, cũng như viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được;

- kết quả cuối cùng thu được nếu kiểm tra độ lặp lại.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CÁC KẾT QUẢ THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

A.1. Cách tiến hành

Một phép thử liên phòng thử nghiệm được tổ chức và thực hiện theo Hướng dẫn thử liên phòng thử nghiệm của AOAC quốc tế ^[9.10] năm 2002. Các mẫu thử được chuẩn bị bằng cách nghiền một lượng thích hợp từ nguyên liệu thử dạng khô bằng thiết bị Retsch ZM1 (lỗ sàng 0,75 mm) hoặc Retsch SR3 (lỗ sàng 1,0 mm). Nguyên liệu sau khi nghiền được trộn đều bằng tay sau đó chia làm nhiều phần trên thiết bị chia mẫu Retsch rotary PTZ, mỗi phần khoảng 50 g. Độ đồng nhất của mẫu con được đánh giá bằng cách phân tích 6 mẫu chọn ngẫu nhiên: nguyên liệu thử được coi là đồng nhất nếu độ lệch chuẩn tương đối lặp lại nhỏ hơn 2 %.

Các phòng thử nghiệm tham gia được lựa chọn dựa trên các kết quả từ nghiên cứu thành thạo phương pháp bao gồm cả tính phù hợp của hệ thống và phân tích 2 mẫu trong đó 1 mẫu có chứa monensin và 1 mẫu chứa salinomycin. Phạm vi nghiên cứu của phương pháp là trên mẫu thử dạng vết (1 mg/kg) đến premix bổ sung thuốc thú y (200 g/kg). Hai mươi lăm mẫu bổ sung thuốc thú y, chín mẫu dạng vết và các mẫu chuẩn đối chứng của ba loại kháng sinh được gửi đến các phòng thử nghiệm tham gia. 10 phòng thử nghiệm đã gửi lại số liệu được chấp nhận trong khoảng thời gian phù hợp. Số liệu từ một phòng thử nghiệm bị loại do không đảm bảo một số yêu cầu của phép thử nghiệm đặt ra.

Các mẫu được thử như sau:

a) Các mẫu bổ sung thuốc thú y (tất cả đều được gửi ở dạng mẫu mù)

b) Mẫu dạng vết (tất cả đều được gửi ở dạng mẫu mù)

1 mẫu thức ăn hoàn chỉnh chứa monensin và narasin, lặp lại

1 mẫu thức ăn hoàn chỉnh chứa salinomycin, làm lặp lại

1 mẫu thức ăn bổ sung dạng lỏng có chứa monensin, mẫu đơn

4 mẫu trắng thức ăn hoàn chỉnh.

Kỹ thuật khẳng định mẫu dương tính (dùng thuốc thử sau cột để thay thế) đã được cung cấp trong thử nghiệm này. Các phòng thử nghiệm tham gia được yêu cầu áp dụng kỹ thuật đó để khẳng định lại đối với tất cả các mẫu dương tính dạng vết.

A.2. Phân tích thống kê các kết quả

Các kết quả thử nghiệm đã được kiểm tra xem có dấu hiệu mắc sai lỗi hệ thống nào không bằng cách sử dụng các phép thử Cochran và Grubbs theo các quy trình được mô tả trong Hướng dẫn nghiên cứu liên phòng thử nghiệm ^[9.10]. Việc tính các giới hạn độ lặp lại (r) và giới hạn độ tái lập (R) theo hướng dẫn ^[9.10] được thực hiện sau khi đã loại trừ ngoại lệ. Các giá trị Horrat, tỉ số giữa độ lệch chuẩn tương đối tái lập thu được với độ lệch chuẩn tương đối tái lập dự kiến đã được tính. Các giá trị Horrat dao động trong khoảng từ 0,5 đến 1,5 là chấp nhận được ^[10] . Các dữ liệu về phương pháp tính (độ lặp lại, độ tái lập và giá trị Horrat) được nêu trong các Bảng từ A.1 đến A.3.

Bảng A.1 – Các kết quả thử nghiệm liên phòng đối với monensin

Bảng A.2 – Các kết quả thử nghiệm liên phòng đối với narasin

Bảng A.3 – Các kết quả thử nghiệm liên phòng đối với salinomycin

A.3. Ví dụ sắc kí

Ví dụ về sắc kí đối với hỗn hợp chuẩn D của HPLC được mô tả ở Hình A.1.

CHÚ DẪN

X: Thời gian lưu, min

Y: Chiều cao của pic, mV hoặc mAU

Nồng độ:

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] LAPOINTE, M.R. and COHEN, H. J. AOAC, 71, 1988, pp. 480-484

[2] GORAS, J.T and LACOURSE, W.R. J. AOAC, 67, 1984, pp. 701-706

[3] BLANCHFOWER, W.J. et al. Analyst, 110, 1985, pp. 1283-1287

[4] RODEWALD, J.M., MORAN, J.W., DONOHO, A.L., COLEMAN, M.R.J. AOAC, 75, 1992, pp. 272-279

[5] RODEWALD, J.M., MORAN, J.W., DONOHO, A.L., COLEMAN, M.R.J. AOAC, 77, 1994, pp. 821-828

[6] AKHTAR, M.H and CROTEAU, L.G. Analyst, 121, 1996, pp. 803-806.

[7] COLEMAN, M.R., MACY, T.D., MORAN, J.W., RODEWALD, J.M. J.AOAC, 77, 1994, pp. 1065-1072

[7] COLEMAN, M.R., MORAN, J.W., MOWREY, D.H. J. AOAC Int, 80, 1997, pp. 693-702.

[9] Collaborative Study Guidelines, J. AOAC Int, 78, 1995, pp. 143A-160A.

[10] Appendix D: Guidelines for Collaborative Study procedures to validate characteristics of a method of analysis, Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th edn, 2000

[11] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002),Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu