Lời nói đầu

QCVN 01-33 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về về quy trình giám định bệnh cây hương lúa biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT ngày 10 tháng 12 năm 2010.

QCVN 01-33 : 2010/BNNPTNT xây dựng nhằm đáp ứng yêu cầu đồng bộ và làm căn cứ áp dụng thống nhất trong công tác kiểm dịch thực vật ở Việt Nam.

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA 

VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH CÂY HƯƠNG LÚA

(Balansia oryzae - sativae Hashioka) LÀ DỊCH HẠI

KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification

of  Udbatta disease(Balansia oryzae - sativae Hashioka)

Plant quarantine pest of Vietnam

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm  vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm II của Việt Nam

1.2.  Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm II thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3.  Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Mẫu:  Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.4. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.5. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.6. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.7. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.8. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

2.1.1. Thu thập mẫu

- Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng

2.1.2. Bảo quản mẫu

- Mẫu cây  sau khi thu thập ngoài đồng được bọc trong giấy bản và chứa trong các túi ni-lông bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 -10^oC.

- Mẫu hạt được chứa trong các túi ni-lông hoặc hộp nhựa kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10-40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40-1000x).

- Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy,  tủ định ôn, cân điện.

- Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo.

- Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong.

- Cồn 70⁰, paraphin, lactophenol, acid acetic, nước cất vô trùng.

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Trên đồng ruộng

Triệu chứng bệnh thường xuất hiện khi lúa trỗ bông. Sợi nấm bó chặt bông lúa bị bệnh khi còn nằm trong bẹ lá đòng. Bông lúa trỗ ra ngoài cũng bị bó chặt, cứng và đứng thẳng trông như que hương và bị bao phủ bởi một lớp nấm trắng, về sau lớp nấm này cứng và có nhiều đốm nhỏ màu đen. Cây bệnh thường còi cọc ( hình 1 và 2 phụ lục A)

2.3.2. Đối với hạt thóc

2.3.2.1. Kiểm tra trực tiếp

- Quan sát dưới kính lúp soi nổi có thể phát hiện thấy hạt bị bệnh nhỏ, lép, hình dạng méo mó, bao phủ bởi bào tử và sợi nấm Balansia oryzae- sativae khô màu trắng xám ( hình 3 và 4 phụ lục A).

- Dùng kim giải phẫu khêu lớp nấm trên hạt đưa lên lam (có chứa sẵn 1-2 giọt lactophenol), sau đó quan sát cấu trúc sợi nấm và bào tử nấm dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100, 200 và 400 lần.    

2.3.2.2. Phương pháp rửa quay ly tâm

- Lấy 400 hạt/ mẫu (chú ý các hạt có triệu chứng điển hình), cho toàn bộ số mẫu vào trong bình tam giác, sau đó đổ nước cất ngập hết mẫu hạt. Thêm 1-2 giọt nước xà phòng.

- Đưa bình tam giác có chứa hạt thóc và nước cất lên máy lắc, lắc hạt trong vòng 10 phút. Lấy phần nước sau khi đã lắc đưa vào ống ly tâm và quay ly tâm với tốc độ 2500 – 3000 vòng/ phút trong 20 phút.

- Bỏ phần nước phía trên, giữ lại phần dưới, có thể nhỏ vài giọt glycerol 2% hoặc Lactophenol để loại bỏ phần cặn thừa phía dưới đáy ống ly tâm, sau đó đưa lên lam và quan sát đặc điểm hình thái của nấm dưới kính hiển vi.

2.4. Đặc điểm hình thái của nấm Balansia oryzae - sativae Hashioka (phụ lục A)

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae  Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh cây hương lúa phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

Phụ lục A

1.Thông tin về dịch hại

1.1. Phân bố và ký chủ

1.1.1.Phân bố

- Trong nước: Bệnh có phân bố ở Thái Nguyên, Bắc Kạn (PQDC, 2004).

- Trên thế giới: Bệnh có phân bố  ở Trung Quốc, Indonesia, Ấn Độ, Nhật, Mỹ và miền tây châu Phi (CABI, 2007).

1.1.2. Ký chủ: Lúa (Oryza sativa), cao lương (Sorghum) mạch đen (Secale cereale) và một số loài cỏ.

1.2.Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên tiếng Việt : Bệnh cây hương lúa

- Tên khoa học: Balansia oryzae- sativae Hashioka, 1971.

- Tên khác: Ephelis pallida Pat.,1897

Ephelis oryzae Syd., 1914

Balansia oryzae (Syd.) Naras. & Thirum., 1943

- Vị trí phân loại: Lớp: Ascomycetes.

 Bộ: Hypocreales

 Họ: Clavicipitaceae

2. Đặc điểm nhận dạng bệnh cây hương lúa  

2.1. Đặc điểm nhận dạng bệnh cây hương lúa trên đồng ruộng.

Hình 1. Bông lúa bị nhiễm bệnh trên đồng ruộng. (Nguồn: Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật, 2004)
Hình 2. Triệu chứng bệnh cây hương lúa trên bông (Nguồn: P.C. Agarwal and S.B. Mathur, Seed-borne diseases of rice, 1988). 2.2. Đặc điểm nhận dạng bệnh cây hương lúa trên hạt thóc
Hình 3. Triệu chứng bệnh trên hạt (trong vòng tròn). (Nguồn: CABI, 2003)	Hình 4. Triệu chứng bệnh trên hạt (Nguồn: Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật, 2004)

3. Đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

Tản nấm cứng không chặt, màu đen hoặc xám nhạt, phát triển và bao quanh trên tất cả chiều dài của bông lúa. Cành bào tử phân nhánh, không màu, kích thước 57- 85 x 0,8 - 1,4 mm. Bào tử không màu, đơn bào, hình kim, thẳng hoặc hơi cong, kích thước 12 - 22 x 1,2 – 1,5 mm ( hình 5 và 6)

Lời nói đầu

QCVN 01-34 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về kiểm dịch thực vật biên soạn,  Cục Bảo vệ thực vật  trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT ngày  10 tháng 12 năm 2010.

QCVN 01-34 : 2010/BNNPTNT được xây dựng nhằm đáp ứng yêu cầu đồng bộ và làm căn cứ áp dụng thống nhất trong công tác kiểm dịch thực vật ở Việt Nam.

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA 

VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG Ditylenchus dipsaci

(Kühn, 1857) Filipjev, 1936 VÀ Ditylenchus destructor  Thorne, 1945

LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification

of  Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 and Ditylenchus destructor

Thorne, 1945 – Plant quarantine pests of Vietnam

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm  vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định Quy trình giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 và Ditylenchus destructor  Thorne, 1945 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

1.2. Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với mọi tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật tại Việt Nam (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 và Ditylenchus destructor Thorne, 1945 là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Tuyến trùng ký sinh thực vật (phytonematoda): Là những loài tuyến trùng chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với thực vật đang phát triển. Chúng sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm rễ, củ, thân, lá và hoa của các thực vật đang phát triển.

1.3.4. Mẫu:  Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.5. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.6. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.7. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.8. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.9. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

1. Thu thập mẫu

- Đối với hàng hoá xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT, QCVN 01-22: 2010/BNNPTNT, QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo phương pháp của qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng.

1. Bảo quản mẫu

Mẫu được lưu giữ và bảo quản như sau:

- Các bộ phận tươi có triệu chứng nghi là tuyến trùng (cành, lá, thân, củ, rễ...) được để trong các túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 5^oC.

- Các sản phẩm khô có triệu chứng nghi là tuyến trùng (hạt, quả khô,...) được để trong các túi ni-lông hoặc hộp nhựa kín có dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Mẫu đất được cho vào túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng mát hoặc ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch có tuyến trùng được tách ra từ bộ phận bị hại để trong các llọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10^oC.

- Tiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10x – 40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40x – 1000x).

- Chậu thuỷ tinh có dung tích 4 lít, cốc thuỷ tinh 100ml, chén thuỷ tinh 4ml, đũa thuỷ tinh, khay men, giấy lọc.

- Kim gắp tuyến trùng, đĩa đồng hồ, kim dầm mẫu, đĩa petri, lam, lamen.

- Rây lọc tuyến trùng có đường kính mắt rây là: 25mm, 75mm, 150mm, 250mm, 700mm, 1.000mm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm.

- Máy ly tâm, tủ định ôn, bình hút ẩm

- Dung dịch ZnSO₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (tỷ trọng 1,18), formaldehyde (40%), glycerol (tinh khiết), triethanolamine (tinh khiết), nước cất.

2.3. Phương pháp tách lọc tuyến trùng

1. Phương pháp tách tuyến trùng từ các bộ phận của cây
   1. Phương pháp kiểm tra trực tiếp

Các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, củ, hạt...) được rửa sạch, chọn các bộ phận của cây có vết tổn thương, biến dạng, biến màu hoặc không bình thường đặt vào đĩa petri. Thêm nước vào đĩa để giữ cho mẫu không bị khô. Đặt đĩa petri có mẫu dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần.

Dùng kim dầm nhẹ mẫu và quan sát tìm tuyến trùng. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần.

1. Phương pháp lọc tĩnh

Mẫu thực vật (thân, rễ, lá...) được rửa sạch, cắt thành những đoạn thật nhỏ (khoảng 0.5mm). Đặt mẫu đã cắt lên trên rây và thêm nước vừa xâm xấp rây. Sau 24 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát  dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

2.3.1.3. Phương pháp ly tâm

Mẫu thực vật (thân, lá, rễ...) được rửa sạch, cắt thành từng đoạn 0,5cm, trộn đều và cân lấy 5-10 gram (tuỳ theo lượng mẫu có). Thêm 250ml nước sạch, nghiền nhỏ mẫu bằng máy xay sinh tố. Lọc qua rây có đường kính 1200mm, dùng vòi nước nhỏ rửa sạch từ phía trên xuống cho đến khi phần mẫu nghiền phía trên rây sạch. Thu phần nước phía dưới và thêm nước cho đủ 1 lít, khuấy đều.

Lấy 100ml dung dịch thu được ở trên cho vào ống nghiệm. Thêm 01 thìa (cà phê) bột cao lanh vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy ly tâm và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút. Sau đó, bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch ZnSO_{4 ­} hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn) và khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ phần dung dịch phía trên của ống ly tâm qua rây lọc có đường kinh 5mm vào cốc thuỷ tinh để kiểm tra. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc thuỷ tinh và tiến hành kiểm tra tuyến trùng tương tự như trên.

1. Phương pháp tách tuyến trùng từ đất
   1. Phương pháp rây Cobb

Cân 100 gram đất cho vào chậu thuỷ tinh, cho thêm 2 – 3 lít nước vào chậu thuỷ tinh và ngâm trong 1 – 2 giờ cho đất tan. Khuấy đều đất và nước, để lắng trong 10 giây. Sau đó lọc qua rây có đường kính 1.000mm, rửa sạch rây và phần cặn trên rây. Dung dịch được thu vào chậu thuỷ tinh thứ 2. Bỏ phần cặn còn lại trên rây và trong chậu thuỷ tinh ban đầu. Quá trình này lặp lại 2-3 lần nhằm loại bỏ cát, sạn, rác và đá.

Khuấy đều dung dịch đã thu được ở trên và tiếp tục lọc bằng rây có đường kính 700mm, dung dịch được thu vào chậu thuỷ tinh. Phần cặn trên rây được rửa sạch và cho vào cốc thuỷ tinh. Tiếp tục lọc dung dịch thu được ở chậu thuỷ tinh qua các rây có đường kính 250mm, 150mm và 25mm. Phần cặn trên rây cũng được rửa sạch và cho vào cốc thuỷ tinh. Riêng với rây 25mm có thể lọc lại 3 – 4 lần.

Nếu lượng nước thu được trong cốc thuỷ tinh quá đầy, để lắng trong 2 giờ và đổ bớt nước phía trên. Tiếp đó, chuyển dung dịch trên sang rây lọc tĩnh. Sau 24 – 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát  dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

1.  Phương pháp phễu lọc Baermann cải tiến

Chuẩn bị khay và lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm. Đặt lớp giấy lọc lên trên mặt lưới. Cân lượng đất cần kiểm tra (tối thiểu là 100gram) và rải đều trên mặt giấy. Thao tác đặt giấy và rải đất phải thật nhẹ để tránh rách, thủng giấy lọc. Đổ nước theo mép khay sao cho nước vừa ướt đất. Sau 24 – 48giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh và kiểm tra dần bằng đĩa đồng hồ dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát  dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Chú ý: Lưới lọc phải có chân hoặc quai (gác lên thành khay) để khi đặt trong khay, đáy của lưới lọc không chạm sát đáy khay.

1.  Phương pháp ly tâm

Cân 100 gram đất vào cốc thuỷ tinh, thêm 250ml nước, khuấy đều. Lọc qua rây có đường kính 1.200mm, dùng vòi nước rửa kỹ phần trên rây, loại bỏ phần cặn còn lại trên rây. Thu phần nước dưới rây, thêm nước cho đủ 1 lít và khuấy đều.

Lấy 100 ml dung dịch thu được ở trên vào ống nghiệm. Thêm 01 thìa cà phê bột cao lanh vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch ZnSO₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn). Khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ dung dịch phía trên qua rây lọc có đường kính 5mm. Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc.

Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

2.4. Phương pháp làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.1. Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng.

* Chú ý: để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước ở nhiệt độ 70–80^oC trong 5 phút.

- Dung dịch 1: Formalin

Dung dịch Formadehyde 4%.

- Dung dịch 2: Formalin - glycerol (FG)

Formalin (40%) Formaldehyde): 10ml

Glycerol:                                                          01ml

Nước cất:                                                         89ml

- Dung dịch 3: TAF

Triethanolamine:                                                02ml

Formalin (40% formaldehyde):                          07ml

Nước cất:                                                         91ml

2.4.2. Phương pháp xử lý và làm tiêu bản tuyến trùng

1.  Phương pháp xử lý tuyến trùng

- Dung dịch xử lý:

Dung dịch 1:     Cồn (96%)                     25ml

                        Glycerol                        01ml

                        Nước cất                      79ml

Dung dịch 2:     Cồn (96%)                     95ml

                        Glycerol                        05ml

- Cách tiến hành:

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thuỷ tinh có chứa 0,5ml dung dịch xử lý (dung dịch 1) . Đặt chén này trong bình hút ẩm đậy kín có chứa 1/10 thể tích cồn 96^o. Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40^oC với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thuỷ tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch 2. Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thuỷ tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40^oC. Sau 2-3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thuỷ tinh cho gần đầy, làm lại 2 – 3 lần. sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong Glycerol  có thể sử dụng làm tiêu bản được.

Hoặc đặt chén thuỷ tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trên trong bình hút ẩm có chứa vôi. Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

1. Phương pháp làm tiêu bản

Lấy lam kính sạch và làm vòng parapin hoặc sáp ong (đường kính khoảng 1cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng parapin hoặc sáp ong. Dùng kim gắp, gắp 5 con tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch cố định) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho parapin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo bảo vệ.

2.5. Trình tự giám định

2.5.1. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần các chỉ tiêu sau

- Hình dạng kim hút, môi, đuôi, tuyến thực quản, đường bên của tuyến trùng, gai giao cấu của con đực, cơ quan sinh sản,  tử cung sau của con cái.

- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái và đực.

- Hình dạng và đo kích thước trứng.

1. So sánh đặc điểm đã quan sát và kết quả đo đếm được với đặc điểm hình thái và giải phẫu của tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev và Ditylenchus destrutor Thorne (phụ lục A) để kết luận.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev hoặc Ditylenchus destrutor Thorne là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (xem phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev hoặc Ditylenchus destrutor Thorne phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định kỹ thuật hiện hành.

Phụ lục A

A.1. Thông tin về dịch hại

A.1.1.  Tuyến trùng Ditylenchus destrutor Thorne

A.1.1.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Châu Mỹ: Canada, Mỹ; Châu Âu: Belgium, Bulgary, Czech Slovakia,  France, Greece, Netherland, Hungary, Ireland, Luxembourg, , Poland, Romania, Spain, Swetzerland, UK; Châu Phi: South Africa; Châu Á: Bangladesh, China, Japan, Korea...;Châu Đại Dương: Australia

- Ký chủ: 90 loại cây trồng và cỏ dại được ghi nhận là ký chủ của loài tuyến trùng này (Esser,1985): khoai tây, củ cải đường, lạc, tỏi, hoa diên vĩ,...

A.1.1.2. Tên khoa học và vị trí phân loại:

- Tên khoa học: Ditylenchus destrutor Thorne, 1945

Tên tiếng Việt: Tuyến trùng gây thối củ

- Vị trí phân loại

Ngành: giun tròn

Lớp: Nematoda

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Anguinidae

A.1.2.  Tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev

A.1.2.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Châu Âu: Albani, Belgium, Austria, Bosnia, Herzegovina, Bulgari, Croatia, Czech Republic, Slovakia, Denmark,  Estonia, Finland, France, Germany, Greece, Hungari, Iceland, Ireland, Italia, Latvia, Lithuania, Macedonia, Malta, Moldova, Netheland, Norway, Poland, Portugal, Romania, Russian Federation, Slovenia, Spain, Sweden, Swetzerland, Ukraina, UK, Yugoslovakia; Châu Á: Armenia, Azerbaijan, China, Cyprus, Georgia, India, Iran, Iraq, Israel, Japan, Jordan, Kazakstan, Kirgizia, Korea, Oman, Pakistan, Syria, Uzbekistan, Yemen; Châu Phi: Algeria, Kenya, Morocco, Nigeria, South Africa, Tunisia; Tây bán cầu: Argeltina, Brazil, Canada, Chile, Colombia, Dominican Republic, Haiti, Mexico, Paraguay, Peru, USA, Uruguay, Venezuela; Châu Đại dưong: Australia, New Zealand

Việt Nam: Hậu Giang

- Ký chủ: Phạm vi ký chủ rất rộng. Chúng được ghi nhận gây hại cho hơn 450 loài thực vật: hành, tỏi, tỏi tây, hoa thuỷ tiên, hoa tuylip, lan dạ hương, cỏ linh lăng, đậu,  khoai tây, củ cải đường,...

A.1.2.2. Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Ditylenchus dipsaci (Kuhn, 1857) Filipjev, 1936

- Tên tiếng Việt: Tuyến trùng thân

- Tên khác (Synonym):

Anguilula dipsaci Kuhn, 1857

Anguinilula similis (Kuhn, 1857) Gervais & Van Beneden, 1859

Tylenchus dipsaci var allocotus Steiner, 1934

Ditylenchus allcotus (Steiner, 1934) Filip & Sch. Stek, 1941

Anguilulina dipsaci var ansinckiae Steiner & Scott, 1935

Ditylenchus ansinckiae (Steiner&Scott 1935) Filip&Sch.Stek ,1941

- Vị trí phân loại

Ngành: giun tròn

Lớp: Nematoda

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Anguinidae

A.2. Đặc điểm nhận dạng

A.2.1. Đặc điểm chung

- Cơ thể hình giun, cutin mỏng, phân đốt. Môi thấp, hơi bằng, liền với cơ thể.

- Khung đầu cutin hoá yếu. Kim hút mảnh, gốc kim hút bé. Thực quản tuyến dạng củ hành rõ ràng hoặc có hình thuỳ. Đuôi hình chóp, mut đuôi tròn hoặc nhọn.

- Con cái có một buồng trứng, lỗ sinh dục nằm phía sau cơ thể. Buồng trứng với các noãn bào xếp thành 1 hoặc 2 dãy. Collumella xếp thành 4 hàng, mỗi hàng có 4 tế bào.

- Con đực: gai giao cấu hơi cong về phía bụng. Tinh trùng lớn. Cánh đuôi kéo dài gần hết mút đuôi.

A.2.2. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Ditylenchus destructor Thorne là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: L=0,8-1,4mm, a=34-35, b=8-10, c=15-20, V=78-83%. tử cung sau kéo dài khoảng ¾ chiều dài từ lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn. Đuôi hình nón, dài 3-5 lần chiều rộng cơ thể tại lỗ hậu môn. Mút đuôi tròn. Có 6 đường bên.

- Con đực: L=0,8 – 1,3mm, a= 34 – 40, b= 7 – 8, c= 12 – 16, T= 73 – 80%. Cơ thể cong về phía bụng. Gai giao cấu lớn, nhô ra cong về phía bụng. Cánh đuôi kéo dài khoảng 4/5 chiều dài đuôi.

- Ấu trùng: Có đặc điểm hình thái tương tự trưởng thành nhưng cơ quan sinh dục chưa phát triển.

- Trứng: Hình oval, chiều dài bằng 2 lần chiều rộng.

Ghi chú:

L: Tổng chiều dài cơ thể (mm hoặc mm)

a: chiều dài cơ thể (mm)/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva) (mm)

b: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản (mm)

c: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài đuôi (mm)

V (%): chiều dài cơ thể từ đỉnh đến vulva (mm)x 100/chiều dài cơ thể (mm)

T (%): chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn (mm) x 100/chiều dài cơ thể (mm)

Hình 1. Tuyến trùng Ditylenchus destructor Thorne

(Nguồn: D.J. Hooper, 1973)

A.2.3. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm II của Việt Nam

- Con cái: L= 1 – 1,3mm, a= 36 - 40, b= 6,5 – 7,1, c=14 - 18, V= 80%. Tử cung sau kéo dài khoảng ½ chiều dài từ lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn. Đuôi hình nón, dài 4-5 lần chiều rộng cơ thể tại lỗ hậu môn. Mút đuôi nhọn. Có 4 đường bên, r ộng kho ảng 1/6 – 1/8 chiều rộng c ơ thể.

- Con đực: L= 1 - 1,3mm, a= 37 – 41, b= 6,5 – 7,3, c= 12 – 15, T= 65 - 72%. Cơ thể gần thẳng khi xử  lý bằng nhiệt. Gai giao cấu lớn, dài 23 - 28mm, cong về phía bụng. Trợ gai ngắn và đơn giản. Cánh đuôi kéo dài khoảng 3/4 chiều dài đuôi.

- Ấu trùng: Có đặc điểm hình thái tương tự trưởng thành nhưng cơ quan sinh dục chưa phát triển.

- Trứng: Hình oval, chiều dài bằng 2 lần chiều rộng.

Hình 2. Tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev

(Nguồn: D.J. Hooper, 1972)

Lưu ý:

Thông thường số lượng cá thể nghiên cứu phải đảm bảo là 30 (n=30). Trong trường hợp số lượng cá thể ít hơn hoặc chỉ phát hiện duy nhất một cá thể có các đặc điểm phân loại như trên có thể cho phép kết luận là  tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev và Ditylenchus destrutor Thorne (chỉ áp dụng đối với các đơn vị đã từng giám định được  tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev và Ditylenchus destrutor Thorne)

Lời nói đầu

QCVN 01-35 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định tuyến trùng bào nang là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam biên soạn,  Cục bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT ngày 10 tháng 12 năm 2010.

QCVN 01-35 : 2010/BNNPTNT được xây dựng nhằm đáp ứng yêu cầu đồng bộ và làm căn cứ áp dụng thống nhất trong công tác kiểm dịch thực vật ở Việt Nam.

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA 

 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG BÀO NANG

Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 VÀ 

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification

of  cyst nematodes (Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 and Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975)

Plant quarantine pests of Vietnam

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm  vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định Quy trình giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

1.2.  Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với mọi tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật tại Việt Nam (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3.  Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Tuyến trùng ký sinh thực vật (phytonematoda): Là những loài tuyến trùng chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với thực vật đang phát triển. Chúng sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm: rễ, củ, thân, lá và hoa của các thực vật đang phát triển.

1.3.4. Tuyến trùng bào nang: Là loài tuyến trùng ký sinh thuộc họ phụ Heteroderinae, Họ Heteroderidae, Bộ: Tylenchida. Trong quá trình phát triển, tuyến trùng cái phình to dần thành hình cầu, hình quả lê hoặc hình hạt chanh. Đẻ trứng ngay trong cơ thể, đến thời điểm nhất định, tuyến trùng cái chết trở thành bào nang bảo vệ trứng trước tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh.

1.3.5. Mẫu:  Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.6. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.7. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.8. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.9. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.10. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

1. Thu thập mẫu

- Đối với hàng hoá xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT, QCVN 01-22: 2010/BNNPTNT, QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo phương pháp của qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng.

1. Bảo quản mẫu

Mẫu được lưu giữ và bảo quản như sau:

- Các bộ phận tươi có triệu chứng nghi là tuyến trùng (củ và rễ) được để trong các túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 5^oC.

- Mẫu đất được cho vào túi ni-lông, có lỗ thông khí, có đính nhãn và để khô tự nhiên ở điều kiện nhiệt độ phòng hoặc sấy ở  nhiệt độ 35– 40⁰C cho đến khi đất khô để bào nang dễ dàng tách rời khỏi đất.

- Dung dịch có tuyến trùng được tách ra từ bộ phận bị hại để trong các lọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10^oC.

- Tiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10x – 40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40x – 1000x).

- Chậu thuỷ tinh có dung tích 4 lít, cốc thuỷ tinh 100ml, chén thuỷ tinh 4ml, đũa thuỷ tinh, khay men, giấy lọc.

- Kim gắp tuyến trùng, đĩa đồng hồ, kim dầm mẫu, đĩa petri, lam, lamen.

- Rây lọc tuyến trùng có đường kính mắt rây là: 25mm, 75mm, 150mm, 250mm, 700mm, 1.000mm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm.

- Máy ly tâm, tủ định ôn, bình hút ẩm

- Dung dịch ZnSo₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (tỷ trọng 1,18), formaldehyde (40%), glycerol (tinh khiết), triethanolamine (tinh khiết), nước cất.

2.3. Phương pháp tách lọc tuyến trùng

2.3.1. Phương pháp tách tuyến trùng bào nang từ các bộ phận của cây

Rửa các bộ phận của cây (rễ, củ) dưới vòi nước thu phần nước rửa và lọc qua rây có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm. Hong khô rây và đưa lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40-70 lần để quan sát và đếm bào nang.

Cắt rễ đã rửa, ngâm trong đĩa Petri có chứa nước. Sau 2-4 giờ, đưa đĩa Petri lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại 40 – 70 lần để quan sát bào nang tuyến trùng.

1. Phương pháp tách tuyến trùng bào nang từ đất

2.3.2.1. Phương pháp giấy lọc Burh: khối lượng mẫu đất từ 5-10gam.

Cho đất vào cốc chứa 0,5 lít nước, cho thêm vào 3-5 giọt dung dịch kiềm bão hoà (NaOH hoặc KOH), khuấy đều.

Đổ hỗn hợp dịch qua rây có đường kính mắt lỗ 2mm để lọc đá, rác.

Lấy giấy lọc cuốn xung quanh mặt trong của cốc thuỷ tinh sao cho 2 mép giấy chồng lên nhau 1cm, đổ dịch lọc vào, khuấy đều theo một chiều trong 3 phút sau đó dừng lại cho bào nang bám vào mép trên giấy lọc.

Lấy nhẹ giấy lọc ra,quan sát trực tiếp bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần, để phát hiện những bào nang nổi dính bám vào phần đường thẳng của vòng giấy tiếp giáp giữa giấy lọc với mặt nước hoặc rửa giấy lọc vào một cốc nước sạch, đổ nước đó lên rây có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm, quan sát bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần .

2.3.2.2. Phương pháp dung dịch NaCL

Khối lượng mẫu đất từ 10-100gam.

Pha dung dịch NaCl ở nồng độ 20%.

Cho đất vào dung dịch NaCl trên, khuấy đều cho bào nang nổi lên.

Đổ hỗn hợp dịch nói trên qua rây có đường kính mắt lỗ 2mm để lọc đá, rác.

Đổ hỗn hợp dịch trên qua rây có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm để giữ lại bào nang.

Quan sát bào nang thu được bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần

2.3.2.3. Phương pháp bình lọc Fenwick (hình 1)

Khối lượng mẫu đất từ 100-200 gam.

Đổ đất vào rây có đường kính mắt lỗ 2mm, xối nước trực tiếp vào đất để đất tan vào bình cho đến khi lượng nước gần đầy bình, loại bỏ phần cặn trên rây.

Mở vòi bình lọc với tốc độ chảy vừa phải sao cho các hạt đất tiếp tục chìm xuống còn bào nang nổi lên trên mặt nước và tràn qua miệng bình theo một máng dẫn xuống rây thu bào nang có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm phía dưới.

Hong khô rây ở nhiệt độ phòng, thu bào nang quan sát và đếm.

Hình 1. Bình Fenwick để tách bào nang trong đất

2.4. Phương pháp làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.1. Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng.

* Chú ý: để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước ở nhiệt độ 70–80^oC trong 5 phút.

- Dung dịch 1: Formalin

Dung dịch Formadehyde 4%.

- Dung dịch 2: Formalin - glycerol (FG)

Formalin (40%) Formaldehyde): 10ml

Glycerol:                                                          01ml

Nước cất:                                                         89ml

- Dung dịch 3: TAF

Triethanolamine:                                                02ml

Formalin (40% formaldehyde):                          07ml

Nước cất:                                                         91ml

2.4.2. Phương pháp xử lý và làm tiêu bản tuyến trùng

1. Phương pháp xử lý tuyến trùng

- Dung dịch xử lý:

Dung dịch 1:     Cồn (96%)                     20ml

                        Glycerol                        01ml

                        Nước cất                      79ml

Dung dịch 2:     Cồn (96%)                     95ml

                        Glycerol                        05ml

- Cách tiến hành:

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thuỷ tinh có chứa 0,5ml dung dịch xử lý (dung dịch 1). Đặt chén này trong bình hút ẩm đậy kín có chứa 1/10 thể tích cồn 96^o. Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 40^oC với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thuỷ tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch 2. Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thuỷ tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở  40^oC. Sau 2-3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thuỷ tinh cho gần đầy, làm lại 2 – 3 lần. Sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong Glycerol có thể sử dụng làm tiêu bản được.

Hoặc đặt chén thuỷ tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trên trong bình hút ẩm có chứa vôi. Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

1. Phương pháp làm tiêu bản

Lấy lam kính sạch và làm vòng parapin hoặc sáp ong (đuờng kính khoảng 1cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng parapin hoặc sáp ong. Dùng kim gắp, gắp tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch cố định) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho parapin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo bảo vệ.

2.4.2.3. Phương pháp làm tiêu bản phần sau bào nang (lỗ sinh dục và lỗ hậu môn)

Ngâm tuyến trùng bào nang đã tách lọc trong nước 24 giờ.

Vớt ra, quan sát dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40 – 70 lần và dùng dao lam cắt lấy phần thân có hậu môn (xem hình 2)

Hình 2. Cách cắt tiêu bản phần thân có hậu môn

Đặt phần thân có hậu môn lên lam kính, nhỏ vài giọt glycerol để quan sát dưới kính hiển vi.

2.5. Trình tự giám định

2.5.1. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần (40x – 1.000x) các chỉ tiêu sau

- Hình dạng và đo chiều dài kim hút, đếm số vòng ở vùng môi, quan sát gai giao cấu và đuôi của tuyến trùng đực

- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái

- Hình dạng và đo kích thước của ấu trùng

- Hình dạng và đo kích thước trứng

- Màu sắc, nếp nhăn  hoặc các đường vân, vị trí lỗ sinh dục của bào nang.

- Đặc điểm lỗ hậu môn

2.5.2. So sánh đặc điểm đã quan sát và kết quả đã đo đếm được với đặc điểm hình thái và giải phẫu của tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (phụ lục A) để kết luận.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (xem phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định kỹ thuật hiện hành.

Phụ lục A

A.1. Thông tin về dịch hại

A.1.1.  Tuyến trùng bào nang khoai tây Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

A.1.1.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Các vùng trồng khoai tây trên thế giới: Châu Phi: Algeria, Tunisia; Bắc Mỹ: Canada; Trung Mỹ và vùng Caribe: Panama; Nam Mỹ: Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Chile,  Venezuela; Châu Á: India, Pakistan, Turkey; Châu Âu: France, Germany, Italia, Belgium, Denmark, Netherland, Porturgal, Libya, Luxembourg, Spain, Austria, Yugoslavia, Swetzerland,  Iceland, Ireland; Châu Đại Dương: NewZealand

- Ký chủ: Khoai tây và cây họ cà: cà chua, cà tím,..

A.1.1.2. Tên khoa học và vị trí phân loại:

- Tên khoa học: Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

Tên tiếng Việt: Tuyến trùng bào nang khoai tây

Tên khác : Heterodera pallida Stone, 1973

- Vị trí phân loại:

Lớp: Nematoda

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

A.1.2.  Tuyến trùng bào nang Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

A.1.2.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố:Các vùng trồng khoai tây trên thế giới

Châu Phi: Algeria, Tunisia, Morocco, South Africa, Libya; Bắc Mỹ: Canada, Mexico, USA; Trung Mỹ và vịnh Caribe: Costarica, Panama; Nam Mỹ: Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Chile,  Venezuela; Châu Á¸: India, Israel, Japan (Hokkaido), Pakistan, Philippine, Lebanon; ChâubÂu : France, Germany, Italia, Belgium, Denmark, Netherland, Portugal, Libya, Luxembourg, Spain, austria, Swetzerland, UK, Yugoslavia, Iceland, Ireland, Poland, Bulgari, Cezch Republic,  Slovakia, Finland, Hungary; Châu Đại Dương: NewZealand, Australia.

- Ký chủ: Khoai tây và cây họ cà: cà chua, cà tím,.

A.1.2.2. Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

- Tên tiếng Việt: Tuyến trùng bào nang ánh vàng khoai tây

- Tên khác (synonym):  

Heterodera schachtii solani Zimmerman, 1927

Heterodera schachtii rostochiensis Wollenweber, 1923

Heterodera (Globodera) rostochiensis Wollenweber,1923 (Skarbilovich, 1959)

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Mulvey & Stone, 1976

Heterodera rostochiensis Wollenweber, 1923 

- Vị trí phân loại:

Ngành:Giun tròn

Lớp:Nematoda

 Bộ:Tylenchida

 Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

A.2. Đặc điểm nhận dạng

A.2.1. Đặc điểm chung

Trứng: Hình bầu dục dài, nằm trong bào nang

Tuyến trùng non: Hình giun, trong quá trình phát triển lên trưởng thành: con đực vần giữ nguyên hình giun, con cái sẽ phình to dần thành hình cầu. Đầu nhô lên, kitin hoá mạnh, chia 6 thuỳ. Kim hút to khoẻ. Có 4 đường bên. Mầm cơ quan sinh dục nằm khoảng 60% chiều dài cơ thể tính từ đỉnh đầu. Đuôi thon, mút đuôi tròn.

Trưởng thành: Con cái: Con cái có dạng hình cầu, mầu trắng hoặc mầu kem. Khung đầu yếu, chia 6 thuỳ. Kim hút đều nhau giữa phần chóp và phần hình trụ. Diều giữa to khỏe. Các cặp buồng trứng lớn, kéo dài trong khoang cơ thể thường chiếm chỗ của tuyến thực quản. Lỗ bài tiết nằm ở chân cổ. Lỗ sinh dục dạng khe nằm ở vùng sinh dục (là vết lõm nằm đối diện với cổ qua phần thân) và được bao quanh bằng các lớp biểu bì mỏng trong mờ và có các nhú.

Bào nang: hình cầu, có lớp vỏ bền và cứng mầu nâu vàng đến nâu sậm hoặc nâu đỏ, có vai trò như một túi bảo vệ trứng bên trong. Lỗ sinh dục(vulva) là đặc điểm hình thái quan trọng để giám định. Đặc điểm của lỗ sinh dục thường bị mất, chỉ còn lại là một lỗ khi bào nang đã thành thục.

Con đực: hình giun, dài hơn 1mm. Đuôi tròn, ngắn, Khung đầu kitin hoá mạnh, có 6 thuỳ. Kim hút khỏe. Diều giữa tròn, van diều giữa hình bán nguyệt. Tinh hoàn đơn. Gai giao cấu cong, gai đệm nhỏ.

Ghi chú:

L: Tổng chiều dài cơ thể (mm hoặc mm)

a: chiều dài cơ thể (mm)/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva) (mm)

b: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản (mm)

c: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài đuôi (mm)

V (%): chiều dài cơ thể từ đỉnh đến vulva (mm)x 100/chiều dài cơ thể (mm)

T (%): chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn (mm) x 100/chiều dài cơ thể (mm)

A.2.2. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang khoai tây Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975  là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5 – 0,8mm. Số đường vân trên biểu bì từ lỗ hậu môn đến lỗ sinh dục = 12,5 ± 3,1

- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42μ

- Bào nang: hình cầu, màu nâu, nhỏ như đầu đinh ghim, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên một giao điểm của các đường vân không tạo thành hình chữ V. Tỉ số Granek = 2,1± 0,9. 

- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khoẻ, dài 27 - 28μ. Gốc chân kim hút to, thô và nhô về phía trước (hình 3). Đầu tuyến trùng thuôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao cấu, đuôi tròn ngắn.

Hình 1: Phần sau bào nang tuyến trùng Globodera pallida (Stone, 1973)

Behrens, 1975 (lỗ hậu môn, lỗ sinh dục, đường vân)

(Nguồn: Tom Powers, 2006)

A.2.3. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5-0,8mm. Số đường vân trên biểu bì từ lỗ hậu môn đến lỗ sinh dục = 21,6 ± 3,5.

- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42μm

- Bào nang: Hình cầu, màu nâu đỏ, nhỏ như đầu đinh ghi, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên giao điểm của các đường vân tạo thành hình chữ V (nhìn như mảnh vòng cung).Tỉ số Granek = 3,6± 0,8 

- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khoẻ, dài 27 - 28μ. Gốc kim hút nhỏ và tròn (hình 3). Đầu tuyến trùng luôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao cấu, đuôi tròn ngắn.

Hình 2: Phần sau bào nang tuyến trùng Globodera rostochiensis (Wollenweber,

1923) Behrens, 1975 (lỗ hậu môn, lỗ sinh dục, đường vân)

(Nguồn: Tom Powers, 2006)

Hình 3: Hình dạng kim hút của tuyến trùng bào nang

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 và Globodera

pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

(Nguồn: Stone, A. R.,1973)

Lưu ý:

Thông thường số lượng cá thể nghiên cứu phải đảm bảo là 30 (n=30). Trong trường hợp số lượng cá thể ít hơn hoặc chỉ phát hiện duy nhất một cá thể có các đặc điểm phân loại như trên có thể cho phép kết luận là  tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (chỉ áp dụng đối với các đơn vị đã từng giám định được tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975)

PHỤ LỤC B (Qui định)

MẪU PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

Tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975  hoặc

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm

dịch thực vật của Việt Nam

1. Tên hàng hoá                            :

2. Nước xuất khẩu                         :

3. Xuất xứ                                     :

4. Phương tiện vận chuyển            :                               Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu                       :

6. Ngày lấy mẫu                            :

7. Người lấy mẫu                          :

8. Tình trạng mẫu                           :

9. Ký hiệu mẫu                              :

10. Số mẫu lưu                             :

11. Người giám định                      :

12. Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về “Quy trình giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam”.

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học:

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

Là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.