Lời nói đầu

QCVN 01-33 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về về quy trình giám định bệnh cây hương lúa biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT ngày 10 tháng 12 năm 2010.

QCVN 01-33 : 2010/BNNPTNT xây dựng nhằm đáp ứng yêu cầu đồng bộ và làm căn cứ áp dụng thống nhất trong công tác kiểm dịch thực vật ở Việt Nam.

 

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA 

VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH CÂY HƯƠNG LÚA

(Balansia oryzae - sativae Hashioka) LÀ DỊCH HẠI

KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification

of  Udbatta disease(Balansia oryzae - sativae Hashioka)

Plant quarantine pest of Vietnam

 

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm  vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm II của Việt Nam

1.2.  Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm II thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3.  Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Mẫu:  Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.4. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.5. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.6. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.7. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.8. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

2.1.1. Thu thập mẫu

- Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng

2.1.2. Bảo quản mẫu

- Mẫu cây  sau khi thu thập ngoài đồng được bọc trong giấy bản và chứa trong các túi ni-lông bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 -10^oC.

- Mẫu hạt được chứa trong các túi ni-lông hoặc hộp nhựa kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10-40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40-1000x).

- Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy,  tủ định ôn, cân điện.

- Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo.

- Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, bình tam giác, cốc đong.

- Cồn 70⁰, paraphin, lactophenol, acid acetic, nước cất vô trùng.

2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh

2.3.1. Trên đồng ruộng

Triệu chứng bệnh thường xuất hiện khi lúa trỗ bông. Sợi nấm bó chặt bông lúa bị bệnh khi còn nằm trong bẹ lá đòng. Bông lúa trỗ ra ngoài cũng bị bó chặt, cứng và đứng thẳng trông như que hương và bị bao phủ bởi một lớp nấm trắng, về sau lớp nấm này cứng và có nhiều đốm nhỏ màu đen. Cây bệnh thường còi cọc ( hình 1 và 2 phụ lục A)

2.3.2. Đối với hạt thóc

2.3.2.1. Kiểm tra trực tiếp

- Quan sát dưới kính lúp soi nổi có thể phát hiện thấy hạt bị bệnh nhỏ, lép, hình dạng méo mó, bao phủ bởi bào tử và sợi nấm Balansia oryzae- sativae khô màu trắng xám ( hình 3 và 4 phụ lục A).

- Dùng kim giải phẫu khêu lớp nấm trên hạt đưa lên lam (có chứa sẵn 1-2 giọt lactophenol), sau đó quan sát cấu trúc sợi nấm và bào tử nấm dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100, 200 và 400 lần.    

2.3.2.2. Phương pháp rửa quay ly tâm

- Lấy 400 hạt/ mẫu (chú ý các hạt có triệu chứng điển hình), cho toàn bộ số mẫu vào trong bình tam giác, sau đó đổ nước cất ngập hết mẫu hạt. Thêm 1-2 giọt nước xà phòng.

- Đưa bình tam giác có chứa hạt thóc và nước cất lên máy lắc, lắc hạt trong vòng 10 phút. Lấy phần nước sau khi đã lắc đưa vào ống ly tâm và quay ly tâm với tốc độ 2500 – 3000 vòng/ phút trong 20 phút.

- Bỏ phần nước phía trên, giữ lại phần dưới, có thể nhỏ vài giọt glycerol 2% hoặc Lactophenol để loại bỏ phần cặn thừa phía dưới đáy ống ly tâm, sau đó đưa lên lam và quan sát đặc điểm hình thái của nấm dưới kính hiển vi.

2.4. Đặc điểm hình thái của nấm Balansia oryzae - sativae Hashioka (phụ lục A)

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae  Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh cây hương lúa phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành.

 

Phụ lục A

 

1.Thông tin về dịch hại

1.1. Phân bố và ký chủ

1.1.1.Phân bố

- Trong nước: Bệnh có phân bố ở Thái Nguyên, Bắc Kạn (PQDC, 2004).

- Trên thế giới: Bệnh có phân bố  ở Trung Quốc, Indonesia, Ấn Độ, Nhật, Mỹ và miền tây châu Phi (CABI, 2007).

1.1.2. Ký chủ: Lúa (Oryza sativa), cao lương (Sorghum) mạch đen (Secale cereale) và một số loài cỏ.

1.2.Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên tiếng Việt : Bệnh cây hương lúa

- Tên khoa học: Balansia oryzae- sativae Hashioka, 1971.

- Tên khác: Ephelis pallida Pat.,1897

Ephelis oryzae Syd., 1914

Balansia oryzae (Syd.) Naras. & Thirum., 1943

- Vị trí phân loại: Lớp: Ascomycetes.

 Bộ: Hypocreales

 Họ: Clavicipitaceae

2. Đặc điểm nhận dạng bệnh cây hương lúa  

2.1. Đặc điểm nhận dạng bệnh cây hương lúa trên đồng ruộng.

3. Đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh cây hương lúa (Balansia oryzae- sativae Hashioka)- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

Tản nấm cứng không chặt, màu đen hoặc xám nhạt, phát triển và bao quanh trên tất cả chiều dài của bông lúa. Cành bào tử phân nhánh, không màu, kích thước 57- 85 x 0,8 - 1,4 mm. Bào tử không màu, đơn bào, hình kim, thẳng hoặc hơi cong, kích thước 12 - 22 x 1,2 – 1,5 mm ( hình 5 và 6)

 

 

Lời nói đầu

QCVN 01-34 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về kiểm dịch thực vật biên soạn,  Cục Bảo vệ thực vật  trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT ngày  10 tháng 12 năm 2010.

QCVN 01-34 : 2010/BNNPTNT được xây dựng nhằm đáp ứng yêu cầu đồng bộ và làm căn cứ áp dụng thống nhất trong công tác kiểm dịch thực vật ở Việt Nam.

 

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA 

VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG Ditylenchus dipsaci

(Kühn, 1857) Filipjev, 1936 VÀ Ditylenchus destructor  Thorne, 1945

LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification

of  Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 and Ditylenchus destructor

Thorne, 1945 – Plant quarantine pests of Vietnam

 

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm  vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định Quy trình giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 và Ditylenchus destructor  Thorne, 1945 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

1.2. Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với mọi tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật tại Việt Nam (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kühn, 1857) Filipjev, 1936 và Ditylenchus destructor Thorne, 1945 là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Tuyến trùng ký sinh thực vật (phytonematoda): Là những loài tuyến trùng chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với thực vật đang phát triển. Chúng sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm rễ, củ, thân, lá và hoa của các thực vật đang phát triển.

1.3.4. Mẫu:  Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.5. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.6. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.7. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.8. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.9. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

1. Thu thập mẫu

- Đối với hàng hoá xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT, QCVN 01-22: 2010/BNNPTNT, QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo phương pháp của qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng.

1. Bảo quản mẫu

Mẫu được lưu giữ và bảo quản như sau:

- Các bộ phận tươi có triệu chứng nghi là tuyến trùng (cành, lá, thân, củ, rễ...) được để trong các túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 5^oC.

- Các sản phẩm khô có triệu chứng nghi là tuyến trùng (hạt, quả khô,...) được để trong các túi ni-lông hoặc hộp nhựa kín có dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

- Mẫu đất được cho vào túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng mát hoặc ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch có tuyến trùng được tách ra từ bộ phận bị hại để trong các llọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10^oC.

- Tiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10x – 40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40x – 1000x).

- Chậu thuỷ tinh có dung tích 4 lít, cốc thuỷ tinh 100ml, chén thuỷ tinh 4ml, đũa thuỷ tinh, khay men, giấy lọc.

- Kim gắp tuyến trùng, đĩa đồng hồ, kim dầm mẫu, đĩa petri, lam, lamen.

- Rây lọc tuyến trùng có đường kính mắt rây là: 25mm, 75mm, 150mm, 250mm, 700mm, 1.000mm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm.

- Máy ly tâm, tủ định ôn, bình hút ẩm

- Dung dịch ZnSO₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (tỷ trọng 1,18), formaldehyde (40%), glycerol (tinh khiết), triethanolamine (tinh khiết), nước cất.

2.3. Phương pháp tách lọc tuyến trùng

1. Phương pháp tách tuyến trùng từ các bộ phận của cây
   1. Phương pháp kiểm tra trực tiếp

Các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, củ, hạt...) được rửa sạch, chọn các bộ phận của cây có vết tổn thương, biến dạng, biến màu hoặc không bình thường đặt vào đĩa petri. Thêm nước vào đĩa để giữ cho mẫu không bị khô. Đặt đĩa petri có mẫu dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần.

Dùng kim dầm nhẹ mẫu và quan sát tìm tuyến trùng. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần.

1. Phương pháp lọc tĩnh

Mẫu thực vật (thân, rễ, lá...) được rửa sạch, cắt thành những đoạn thật nhỏ (khoảng 0.5mm). Đặt mẫu đã cắt lên trên rây và thêm nước vừa xâm xấp rây. Sau 24 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát  dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

2.3.1.3. Phương pháp ly tâm

Mẫu thực vật (thân, lá, rễ...) được rửa sạch, cắt thành từng đoạn 0,5cm, trộn đều và cân lấy 5-10 gram (tuỳ theo lượng mẫu có). Thêm 250ml nước sạch, nghiền nhỏ mẫu bằng máy xay sinh tố. Lọc qua rây có đường kính 1200mm, dùng vòi nước nhỏ rửa sạch từ phía trên xuống cho đến khi phần mẫu nghiền phía trên rây sạch. Thu phần nước phía dưới và thêm nước cho đủ 1 lít, khuấy đều.

Lấy 100ml dung dịch thu được ở trên cho vào ống nghiệm. Thêm 01 thìa (cà phê) bột cao lanh vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy ly tâm và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút. Sau đó, bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch ZnSO_{4 ­} hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn) và khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ phần dung dịch phía trên của ống ly tâm qua rây lọc có đường kinh 5mm vào cốc thuỷ tinh để kiểm tra. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc thuỷ tinh và tiến hành kiểm tra tuyến trùng tương tự như trên.

1. Phương pháp tách tuyến trùng từ đất
   1. Phương pháp rây Cobb

Cân 100 gram đất cho vào chậu thuỷ tinh, cho thêm 2 – 3 lít nước vào chậu thuỷ tinh và ngâm trong 1 – 2 giờ cho đất tan. Khuấy đều đất và nước, để lắng trong 10 giây. Sau đó lọc qua rây có đường kính 1.000mm, rửa sạch rây và phần cặn trên rây. Dung dịch được thu vào chậu thuỷ tinh thứ 2. Bỏ phần cặn còn lại trên rây và trong chậu thuỷ tinh ban đầu. Quá trình này lặp lại 2-3 lần nhằm loại bỏ cát, sạn, rác và đá.

Khuấy đều dung dịch đã thu được ở trên và tiếp tục lọc bằng rây có đường kính 700mm, dung dịch được thu vào chậu thuỷ tinh. Phần cặn trên rây được rửa sạch và cho vào cốc thuỷ tinh. Tiếp tục lọc dung dịch thu được ở chậu thuỷ tinh qua các rây có đường kính 250mm, 150mm và 25mm. Phần cặn trên rây cũng được rửa sạch và cho vào cốc thuỷ tinh. Riêng với rây 25mm có thể lọc lại 3 – 4 lần.

Nếu lượng nước thu được trong cốc thuỷ tinh quá đầy, để lắng trong 2 giờ và đổ bớt nước phía trên. Tiếp đó, chuyển dung dịch trên sang rây lọc tĩnh. Sau 24 – 48 giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh. Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát  dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

1.  Phương pháp phễu lọc Baermann cải tiến

Chuẩn bị khay và lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm. Đặt lớp giấy lọc lên trên mặt lưới. Cân lượng đất cần kiểm tra (tối thiểu là 100gram) và rải đều trên mặt giấy. Thao tác đặt giấy và rải đất phải thật nhẹ để tránh rách, thủng giấy lọc. Đổ nước theo mép khay sao cho nước vừa ướt đất. Sau 24 – 48giờ, đổ nước dưới rây vào cốc thuỷ tinh và kiểm tra dần bằng đĩa đồng hồ dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát  dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

Chú ý: Lưới lọc phải có chân hoặc quai (gác lên thành khay) để khi đặt trong khay, đáy của lưới lọc không chạm sát đáy khay.

1.  Phương pháp ly tâm

Cân 100 gram đất vào cốc thuỷ tinh, thêm 250ml nước, khuấy đều. Lọc qua rây có đường kính 1.200mm, dùng vòi nước rửa kỹ phần trên rây, loại bỏ phần cặn còn lại trên rây. Thu phần nước dưới rây, thêm nước cho đủ 1 lít và khuấy đều.

Lấy 100 ml dung dịch thu được ở trên vào ống nghiệm. Thêm 01 thìa cà phê bột cao lanh vào ống và khuấy đều bằng máy khuấy. Đặt ống nghiệm vào máy và ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần cặn phía dưới. Thêm dung dịch ZnSO₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (cao hơn 1cm so với bề mặt của lớp cặn). Khuấy đều trong 1 phút. Tiếp tục ly tâm với vận tốc 1.800 vòng/phút trong 4 phút.

Đổ dung dịch phía trên qua rây lọc có đường kính 5mm. Rửa phần trên rây bằng nước sạch và dùng bình xịt nước để rửa, thu tuyến trùng bám dính trên rây vào cốc.

Dùng ống hút lấy dung dịch thu được ở cốc thuỷ tinh cho vào đĩa đồng hồ và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 – 40 lần. Nếu phát hiện thấy tuyến trùng, dùng kim gắp tuyến trùng lên lam và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần. Kiểm tra lần lượt cho đến khi hết nước trong cốc thuỷ tinh.

2.4. Phương pháp làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.1. Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng.

* Chú ý: để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước ở nhiệt độ 70–80^oC trong 5 phút.

- Dung dịch 1: Formalin

Dung dịch Formadehyde 4%.

- Dung dịch 2: Formalin - glycerol (FG)

Formalin (40%) Formaldehyde): 10ml

Glycerol:                                                          01ml

Nước cất:                                                         89ml

- Dung dịch 3: TAF

Triethanolamine:                                                02ml

Formalin (40% formaldehyde):                          07ml

Nước cất:                                                         91ml

2.4.2. Phương pháp xử lý và làm tiêu bản tuyến trùng

1.  Phương pháp xử lý tuyến trùng

- Dung dịch xử lý:

Dung dịch 1:     Cồn (96%)                     25ml

                        Glycerol                        01ml

                        Nước cất                      79ml

Dung dịch 2:     Cồn (96%)                     95ml

                        Glycerol                        05ml

- Cách tiến hành:

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thuỷ tinh có chứa 0,5ml dung dịch xử lý (dung dịch 1) . Đặt chén này trong bình hút ẩm đậy kín có chứa 1/10 thể tích cồn 96^o. Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40^oC với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thuỷ tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch 2. Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thuỷ tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40^oC. Sau 2-3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thuỷ tinh cho gần đầy, làm lại 2 – 3 lần. sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong Glycerol  có thể sử dụng làm tiêu bản được.

Hoặc đặt chén thuỷ tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trên trong bình hút ẩm có chứa vôi. Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

1. Phương pháp làm tiêu bản

Lấy lam kính sạch và làm vòng parapin hoặc sáp ong (đường kính khoảng 1cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng parapin hoặc sáp ong. Dùng kim gắp, gắp 5 con tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch cố định) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho parapin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo bảo vệ.

2.5. Trình tự giám định

2.5.1. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần các chỉ tiêu sau

- Hình dạng kim hút, môi, đuôi, tuyến thực quản, đường bên của tuyến trùng, gai giao cấu của con đực, cơ quan sinh sản,  tử cung sau của con cái.

- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái và đực.

- Hình dạng và đo kích thước trứng.

1. So sánh đặc điểm đã quan sát và kết quả đo đếm được với đặc điểm hình thái và giải phẫu của tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev và Ditylenchus destrutor Thorne (phụ lục A) để kết luận.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev hoặc Ditylenchus destrutor Thorne là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (xem phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev hoặc Ditylenchus destrutor Thorne phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định kỹ thuật hiện hành.

 

Phụ lục A

 

A.1. Thông tin về dịch hại

A.1.1.  Tuyến trùng Ditylenchus destrutor Thorne

A.1.1.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Châu Mỹ: Canada, Mỹ; Châu Âu: Belgium, Bulgary, Czech Slovakia,  France, Greece, Netherland, Hungary, Ireland, Luxembourg, , Poland, Romania, Spain, Swetzerland, UK; Châu Phi: South Africa; Châu Á: Bangladesh, China, Japan, Korea...;Châu Đại Dương: Australia

- Ký chủ: 90 loại cây trồng và cỏ dại được ghi nhận là ký chủ của loài tuyến trùng này (Esser,1985): khoai tây, củ cải đường, lạc, tỏi, hoa diên vĩ,...

A.1.1.2. Tên khoa học và vị trí phân loại:

- Tên khoa học: Ditylenchus destrutor Thorne, 1945

Tên tiếng Việt: Tuyến trùng gây thối củ

- Vị trí phân loại

Ngành: giun tròn

Lớp: Nematoda

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Anguinidae

A.1.2.  Tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev

A.1.2.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Châu Âu: Albani, Belgium, Austria, Bosnia, Herzegovina, Bulgari, Croatia, Czech Republic, Slovakia, Denmark,  Estonia, Finland, France, Germany, Greece, Hungari, Iceland, Ireland, Italia, Latvia, Lithuania, Macedonia, Malta, Moldova, Netheland, Norway, Poland, Portugal, Romania, Russian Federation, Slovenia, Spain, Sweden, Swetzerland, Ukraina, UK, Yugoslovakia; Châu Á: Armenia, Azerbaijan, China, Cyprus, Georgia, India, Iran, Iraq, Israel, Japan, Jordan, Kazakstan, Kirgizia, Korea, Oman, Pakistan, Syria, Uzbekistan, Yemen; Châu Phi: Algeria, Kenya, Morocco, Nigeria, South Africa, Tunisia; Tây bán cầu: Argeltina, Brazil, Canada, Chile, Colombia, Dominican Republic, Haiti, Mexico, Paraguay, Peru, USA, Uruguay, Venezuela; Châu Đại dưong: Australia, New Zealand

Việt Nam: Hậu Giang

- Ký chủ: Phạm vi ký chủ rất rộng. Chúng được ghi nhận gây hại cho hơn 450 loài thực vật: hành, tỏi, tỏi tây, hoa thuỷ tiên, hoa tuylip, lan dạ hương, cỏ linh lăng, đậu,  khoai tây, củ cải đường,...

A.1.2.2. Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Ditylenchus dipsaci (Kuhn, 1857) Filipjev, 1936

- Tên tiếng Việt: Tuyến trùng thân

- Tên khác (Synonym):

Anguilula dipsaci Kuhn, 1857

Anguinilula similis (Kuhn, 1857) Gervais & Van Beneden, 1859

Tylenchus dipsaci var allocotus Steiner, 1934

Ditylenchus allcotus (Steiner, 1934) Filip & Sch. Stek, 1941

Anguilulina dipsaci var ansinckiae Steiner & Scott, 1935

Ditylenchus ansinckiae (Steiner&Scott 1935) Filip&Sch.Stek ,1941

- Vị trí phân loại

Ngành: giun tròn

Lớp: Nematoda

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Anguinidae

A.2. Đặc điểm nhận dạng

A.2.1. Đặc điểm chung

- Cơ thể hình giun, cutin mỏng, phân đốt. Môi thấp, hơi bằng, liền với cơ thể.

- Khung đầu cutin hoá yếu. Kim hút mảnh, gốc kim hút bé. Thực quản tuyến dạng củ hành rõ ràng hoặc có hình thuỳ. Đuôi hình chóp, mut đuôi tròn hoặc nhọn.

- Con cái có một buồng trứng, lỗ sinh dục nằm phía sau cơ thể. Buồng trứng với các noãn bào xếp thành 1 hoặc 2 dãy. Collumella xếp thành 4 hàng, mỗi hàng có 4 tế bào.

- Con đực: gai giao cấu hơi cong về phía bụng. Tinh trùng lớn. Cánh đuôi kéo dài gần hết mút đuôi.

A.2.2. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Ditylenchus destructor Thorne là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: L=0,8-1,4mm, a=34-35, b=8-10, c=15-20, V=78-83%. tử cung sau kéo dài khoảng ¾ chiều dài từ lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn. Đuôi hình nón, dài 3-5 lần chiều rộng cơ thể tại lỗ hậu môn. Mút đuôi tròn. Có 6 đường bên.

- Con đực: L=0,8 – 1,3mm, a= 34 – 40, b= 7 – 8, c= 12 – 16, T= 73 – 80%. Cơ thể cong về phía bụng. Gai giao cấu lớn, nhô ra cong về phía bụng. Cánh đuôi kéo dài khoảng 4/5 chiều dài đuôi.

- Ấu trùng: Có đặc điểm hình thái tương tự trưởng thành nhưng cơ quan sinh dục chưa phát triển.

- Trứng: Hình oval, chiều dài bằng 2 lần chiều rộng.

Ghi chú:

L: Tổng chiều dài cơ thể (mm hoặc mm)

a: chiều dài cơ thể (mm)/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva) (mm)

b: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản (mm)

c: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài đuôi (mm)

V (%): chiều dài cơ thể từ đỉnh đến vulva (mm)x 100/chiều dài cơ thể (mm)

T (%): chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn (mm) x 100/chiều dài cơ thể (mm)

 

 

Hình 1. Tuyến trùng Ditylenchus destructor Thorne

(Nguồn: D.J. Hooper, 1973)

A.2.3. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm II của Việt Nam

- Con cái: L= 1 – 1,3mm, a= 36 - 40, b= 6,5 – 7,1, c=14 - 18, V= 80%. Tử cung sau kéo dài khoảng ½ chiều dài từ lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn. Đuôi hình nón, dài 4-5 lần chiều rộng cơ thể tại lỗ hậu môn. Mút đuôi nhọn. Có 4 đường bên, r ộng kho ảng 1/6 – 1/8 chiều rộng c ơ thể.

- Con đực: L= 1 - 1,3mm, a= 37 – 41, b= 6,5 – 7,3, c= 12 – 15, T= 65 - 72%. Cơ thể gần thẳng khi xử  lý bằng nhiệt. Gai giao cấu lớn, dài 23 - 28mm, cong về phía bụng. Trợ gai ngắn và đơn giản. Cánh đuôi kéo dài khoảng 3/4 chiều dài đuôi.

- Ấu trùng: Có đặc điểm hình thái tương tự trưởng thành nhưng cơ quan sinh dục chưa phát triển.

- Trứng: Hình oval, chiều dài bằng 2 lần chiều rộng.

 

Hình 2. Tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev

(Nguồn: D.J. Hooper, 1972)

Lưu ý:

Thông thường số lượng cá thể nghiên cứu phải đảm bảo là 30 (n=30). Trong trường hợp số lượng cá thể ít hơn hoặc chỉ phát hiện duy nhất một cá thể có các đặc điểm phân loại như trên có thể cho phép kết luận là  tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev và Ditylenchus destrutor Thorne (chỉ áp dụng đối với các đơn vị đã từng giám định được  tuyến trùng Ditylenchus dipsaci (Kuhn) Filipjev và Ditylenchus destrutor Thorne)

 

 

Lời nói đầu

QCVN 01-35 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định tuyến trùng bào nang là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam biên soạn,  Cục bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT ngày 10 tháng 12 năm 2010.

QCVN 01-35 : 2010/BNNPTNT được xây dựng nhằm đáp ứng yêu cầu đồng bộ và làm căn cứ áp dụng thống nhất trong công tác kiểm dịch thực vật ở Việt Nam.

 

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA 

 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH TUYẾN TRÙNG BÀO NANG

Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 VÀ 

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM

National technical regulation on Procedure for identification

of  cyst nematodes (Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 and Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975)

Plant quarantine pests of Vietnam

 

I . QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm  vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định Quy trình giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

1.2.  Đối tượng áp dụng

Quy chuẩn này áp dụng đối với mọi tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật tại Việt Nam (viết tắt là KDTV) thực hiện giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hại KDTV của Việt Nam ban hành kèm theo Quyết định số 73/2005/QĐ-BNN ngày 14/11/2005 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT.

1.3.  Giải thích từ ngữ

Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật: Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân bố hẹp và phải được kiểm soát chính thức.

1.3.2. Thực vật: Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống.

1.3.3. Tuyến trùng ký sinh thực vật (phytonematoda): Là những loài tuyến trùng chủ yếu sống trong đất và có quan hệ chặt chẽ với thực vật đang phát triển. Chúng sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật bao gồm: rễ, củ, thân, lá và hoa của các thực vật đang phát triển.

1.3.4. Tuyến trùng bào nang: Là loài tuyến trùng ký sinh thuộc họ phụ Heteroderinae, Họ Heteroderidae, Bộ: Tylenchida. Trong quá trình phát triển, tuyến trùng cái phình to dần thành hình cầu, hình quả lê hoặc hình hạt chanh. Đẻ trứng ngay trong cơ thể, đến thời điểm nhất định, tuyến trùng cái chết trở thành bào nang bảo vệ trứng trước tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh.

1.3.5. Mẫu:  Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra theo một qui tắc nhất định.

1.3.6. Mẫu ban đầu: Là khối lượng mẫu thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy ra từ một vị trí trong lô vật thể.

1.3.7. Mẫu chung: Là mẫu gộp các mẫu ban đầu.

1.3.8. Mẫu trung bình: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được lấy từ mẫu chung theo một qui tắc nhất định, dùng làm mẫu lưu và mẫu phân tích.

1.3.9. Mẫu phân tích: Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật, tàn dư của sản phẩm thực vật hoặc đất được dùng để phân tích, giám định dịch hại trong phòng thí nghiệm.

1.3.10. Tiêu bản: Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập.

II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT

2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu

1. Thu thập mẫu

- Đối với hàng hoá xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731-89, Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT, QCVN 01-22: 2010/BNNPTNT, QCVN 01-23: 2010/BNNPTNT.

- Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo phương pháp của qui chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng.

1. Bảo quản mẫu

Mẫu được lưu giữ và bảo quản như sau:

- Các bộ phận tươi có triệu chứng nghi là tuyến trùng (củ và rễ) được để trong các túi ni-lông có lỗ thông khí, có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 5^oC.

- Mẫu đất được cho vào túi ni-lông, có lỗ thông khí, có đính nhãn và để khô tự nhiên ở điều kiện nhiệt độ phòng hoặc sấy ở  nhiệt độ 35– 40⁰C cho đến khi đất khô để bào nang dễ dàng tách rời khỏi đất.

- Dung dịch có tuyến trùng được tách ra từ bộ phận bị hại để trong các lọ kín có dán nhãn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 10^oC.

- Tiêu bản lam phải có nhãn ký hiệu mẫu, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng làm tiêu bản và giám định

- Kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10 – 40 lần (10x – 40x), kính hiển vi có độ phóng đại 40 – 1.000 lần (40x – 1000x).

- Chậu thuỷ tinh có dung tích 4 lít, cốc thuỷ tinh 100ml, chén thuỷ tinh 4ml, đũa thuỷ tinh, khay men, giấy lọc.

- Kim gắp tuyến trùng, đĩa đồng hồ, kim dầm mẫu, đĩa petri, lam, lamen.

- Rây lọc tuyến trùng có đường kính mắt rây là: 25mm, 75mm, 150mm, 250mm, 700mm, 1.000mm, lưới lọc có đường kính mắt lưới 2mm.

- Máy ly tâm, tủ định ôn, bình hút ẩm

- Dung dịch ZnSo₄ hoặc MgSO₄ hoặc đường sacazosa (tỷ trọng 1,18), formaldehyde (40%), glycerol (tinh khiết), triethanolamine (tinh khiết), nước cất.

2.3. Phương pháp tách lọc tuyến trùng

2.3.1. Phương pháp tách tuyến trùng bào nang từ các bộ phận của cây

Rửa các bộ phận của cây (rễ, củ) dưới vòi nước thu phần nước rửa và lọc qua rây có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm. Hong khô rây và đưa lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40-70 lần để quan sát và đếm bào nang.

Cắt rễ đã rửa, ngâm trong đĩa Petri có chứa nước. Sau 2-4 giờ, đưa đĩa Petri lên kính lúp soi nổi có độ phóng đại 40 – 70 lần để quan sát bào nang tuyến trùng.

1. Phương pháp tách tuyến trùng bào nang từ đất

2.3.2.1. Phương pháp giấy lọc Burh: khối lượng mẫu đất từ 5-10gam.

Cho đất vào cốc chứa 0,5 lít nước, cho thêm vào 3-5 giọt dung dịch kiềm bão hoà (NaOH hoặc KOH), khuấy đều.

Đổ hỗn hợp dịch qua rây có đường kính mắt lỗ 2mm để lọc đá, rác.

Lấy giấy lọc cuốn xung quanh mặt trong của cốc thuỷ tinh sao cho 2 mép giấy chồng lên nhau 1cm, đổ dịch lọc vào, khuấy đều theo một chiều trong 3 phút sau đó dừng lại cho bào nang bám vào mép trên giấy lọc.

Lấy nhẹ giấy lọc ra,quan sát trực tiếp bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần, để phát hiện những bào nang nổi dính bám vào phần đường thẳng của vòng giấy tiếp giáp giữa giấy lọc với mặt nước hoặc rửa giấy lọc vào một cốc nước sạch, đổ nước đó lên rây có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm, quan sát bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần .

2.3.2.2. Phương pháp dung dịch NaCL

Khối lượng mẫu đất từ 10-100gam.

Pha dung dịch NaCl ở nồng độ 20%.

Cho đất vào dung dịch NaCl trên, khuấy đều cho bào nang nổi lên.

Đổ hỗn hợp dịch nói trên qua rây có đường kính mắt lỗ 2mm để lọc đá, rác.

Đổ hỗn hợp dịch trên qua rây có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm để giữ lại bào nang.

Quan sát bào nang thu được bằng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần

2.3.2.3. Phương pháp bình lọc Fenwick (hình 1)

Khối lượng mẫu đất từ 100-200 gam.

Đổ đất vào rây có đường kính mắt lỗ 2mm, xối nước trực tiếp vào đất để đất tan vào bình cho đến khi lượng nước gần đầy bình, loại bỏ phần cặn trên rây.

Mở vòi bình lọc với tốc độ chảy vừa phải sao cho các hạt đất tiếp tục chìm xuống còn bào nang nổi lên trên mặt nước và tràn qua miệng bình theo một máng dẫn xuống rây thu bào nang có đường kính mắt lỗ 0,05-0,1mm phía dưới.

Hong khô rây ở nhiệt độ phòng, thu bào nang quan sát và đếm.

Hình 1. Bình Fenwick để tách bào nang trong đất

2.4. Phương pháp làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.1. Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng.

* Chú ý: để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước ở nhiệt độ 70–80^oC trong 5 phút.

- Dung dịch 1: Formalin

Dung dịch Formadehyde 4%.

- Dung dịch 2: Formalin - glycerol (FG)

Formalin (40%) Formaldehyde): 10ml

Glycerol:                                                          01ml

Nước cất:                                                         89ml

- Dung dịch 3: TAF

Triethanolamine:                                                02ml

Formalin (40% formaldehyde):                          07ml

Nước cất:                                                         91ml

2.4.2. Phương pháp xử lý và làm tiêu bản tuyến trùng

1. Phương pháp xử lý tuyến trùng

- Dung dịch xử lý:

Dung dịch 1:     Cồn (96%)                     20ml

                        Glycerol                        01ml

                        Nước cất                      79ml

Dung dịch 2:     Cồn (96%)                     95ml

                        Glycerol                        05ml

- Cách tiến hành:

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thuỷ tinh có chứa 0,5ml dung dịch xử lý (dung dịch 1). Đặt chén này trong bình hút ẩm đậy kín có chứa 1/10 thể tích cồn 96^o. Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 40^oC với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thuỷ tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch 2. Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thuỷ tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở  40^oC. Sau 2-3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thuỷ tinh cho gần đầy, làm lại 2 – 3 lần. Sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong Glycerol có thể sử dụng làm tiêu bản được.

Hoặc đặt chén thuỷ tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trên trong bình hút ẩm có chứa vôi. Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

1. Phương pháp làm tiêu bản

Lấy lam kính sạch và làm vòng parapin hoặc sáp ong (đuờng kính khoảng 1cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng parapin hoặc sáp ong. Dùng kim gắp, gắp tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch cố định) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho parapin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo bảo vệ.

2.4.2.3. Phương pháp làm tiêu bản phần sau bào nang (lỗ sinh dục và lỗ hậu môn)

Ngâm tuyến trùng bào nang đã tách lọc trong nước 24 giờ.

Vớt ra, quan sát dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40 – 70 lần và dùng dao lam cắt lấy phần thân có hậu môn (xem hình 2)

Hình 2. Cách cắt tiêu bản phần thân có hậu môn

Đặt phần thân có hậu môn lên lam kính, nhỏ vài giọt glycerol để quan sát dưới kính hiển vi.

2.5. Trình tự giám định

2.5.1. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần (40x – 1.000x) các chỉ tiêu sau

- Hình dạng và đo chiều dài kim hút, đếm số vòng ở vùng môi, quan sát gai giao cấu và đuôi của tuyến trùng đực

- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái

- Hình dạng và đo kích thước của ấu trùng

- Hình dạng và đo kích thước trứng

- Màu sắc, nếp nhăn  hoặc các đường vân, vị trí lỗ sinh dục của bào nang.

- Đặc điểm lỗ hậu môn

2.5.2. So sánh đặc điểm đã quan sát và kết quả đã đo đếm được với đặc điểm hình thái và giải phẫu của tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (phụ lục A) để kết luận.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (xem phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định kỹ thuật hiện hành.

 

Phụ lục A

 

A.1. Thông tin về dịch hại

A.1.1.  Tuyến trùng bào nang khoai tây Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

A.1.1.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Các vùng trồng khoai tây trên thế giới: Châu Phi: Algeria, Tunisia; Bắc Mỹ: Canada; Trung Mỹ và vùng Caribe: Panama; Nam Mỹ: Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Chile,  Venezuela; Châu Á: India, Pakistan, Turkey; Châu Âu: France, Germany, Italia, Belgium, Denmark, Netherland, Porturgal, Libya, Luxembourg, Spain, Austria, Yugoslavia, Swetzerland,  Iceland, Ireland; Châu Đại Dương: NewZealand

- Ký chủ: Khoai tây và cây họ cà: cà chua, cà tím,..

A.1.1.2. Tên khoa học và vị trí phân loại:

- Tên khoa học: Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

Tên tiếng Việt: Tuyến trùng bào nang khoai tây

Tên khác : Heterodera pallida Stone, 1973

- Vị trí phân loại:

Lớp: Nematoda

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

A.1.2.  Tuyến trùng bào nang Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

A.1.2.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố:Các vùng trồng khoai tây trên thế giới

Châu Phi: Algeria, Tunisia, Morocco, South Africa, Libya; Bắc Mỹ: Canada, Mexico, USA; Trung Mỹ và vịnh Caribe: Costarica, Panama; Nam Mỹ: Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Chile,  Venezuela; Châu Á¸: India, Israel, Japan (Hokkaido), Pakistan, Philippine, Lebanon; ChâubÂu : France, Germany, Italia, Belgium, Denmark, Netherland, Portugal, Libya, Luxembourg, Spain, austria, Swetzerland, UK, Yugoslavia, Iceland, Ireland, Poland, Bulgari, Cezch Republic,  Slovakia, Finland, Hungary; Châu Đại Dương: NewZealand, Australia.

- Ký chủ: Khoai tây và cây họ cà: cà chua, cà tím,.

A.1.2.2. Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

- Tên tiếng Việt: Tuyến trùng bào nang ánh vàng khoai tây

- Tên khác (synonym):  

Heterodera schachtii solani Zimmerman, 1927

Heterodera schachtii rostochiensis Wollenweber, 1923

Heterodera (Globodera) rostochiensis Wollenweber,1923 (Skarbilovich, 1959)

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Mulvey & Stone, 1976

Heterodera rostochiensis Wollenweber, 1923 

- Vị trí phân loại:

Ngành:Giun tròn

Lớp:Nematoda

 Bộ:Tylenchida

 Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

A.2. Đặc điểm nhận dạng

A.2.1. Đặc điểm chung

Trứng: Hình bầu dục dài, nằm trong bào nang

Tuyến trùng non: Hình giun, trong quá trình phát triển lên trưởng thành: con đực vần giữ nguyên hình giun, con cái sẽ phình to dần thành hình cầu. Đầu nhô lên, kitin hoá mạnh, chia 6 thuỳ. Kim hút to khoẻ. Có 4 đường bên. Mầm cơ quan sinh dục nằm khoảng 60% chiều dài cơ thể tính từ đỉnh đầu. Đuôi thon, mút đuôi tròn.

Trưởng thành: Con cái: Con cái có dạng hình cầu, mầu trắng hoặc mầu kem. Khung đầu yếu, chia 6 thuỳ. Kim hút đều nhau giữa phần chóp và phần hình trụ. Diều giữa to khỏe. Các cặp buồng trứng lớn, kéo dài trong khoang cơ thể thường chiếm chỗ của tuyến thực quản. Lỗ bài tiết nằm ở chân cổ. Lỗ sinh dục dạng khe nằm ở vùng sinh dục (là vết lõm nằm đối diện với cổ qua phần thân) và được bao quanh bằng các lớp biểu bì mỏng trong mờ và có các nhú.

Bào nang: hình cầu, có lớp vỏ bền và cứng mầu nâu vàng đến nâu sậm hoặc nâu đỏ, có vai trò như một túi bảo vệ trứng bên trong. Lỗ sinh dục(vulva) là đặc điểm hình thái quan trọng để giám định. Đặc điểm của lỗ sinh dục thường bị mất, chỉ còn lại là một lỗ khi bào nang đã thành thục.

Con đực: hình giun, dài hơn 1mm. Đuôi tròn, ngắn, Khung đầu kitin hoá mạnh, có 6 thuỳ. Kim hút khỏe. Diều giữa tròn, van diều giữa hình bán nguyệt. Tinh hoàn đơn. Gai giao cấu cong, gai đệm nhỏ.

Ghi chú:

L: Tổng chiều dài cơ thể (mm hoặc mm)

a: chiều dài cơ thể (mm)/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva) (mm)

b: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản (mm)

c: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài đuôi (mm)

V (%): chiều dài cơ thể từ đỉnh đến vulva (mm)x 100/chiều dài cơ thể (mm)

T (%): chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn (mm) x 100/chiều dài cơ thể (mm)

A.2.2. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang khoai tây Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975  là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5 – 0,8mm. Số đường vân trên biểu bì từ lỗ hậu môn đến lỗ sinh dục = 12,5 ± 3,1

- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42μ

- Bào nang: hình cầu, màu nâu, nhỏ như đầu đinh ghim, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên một giao điểm của các đường vân không tạo thành hình chữ V. Tỉ số Granek = 2,1± 0,9. 

- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khoẻ, dài 27 - 28μ. Gốc chân kim hút to, thô và nhô về phía trước (hình 3). Đầu tuyến trùng thuôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao cấu, đuôi tròn ngắn.

     

Hình 1: Phần sau bào nang tuyến trùng Globodera pallida (Stone, 1973)

Behrens, 1975 (lỗ hậu môn, lỗ sinh dục, đường vân)

(Nguồn: Tom Powers, 2006)

A.2.3. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5-0,8mm. Số đường vân trên biểu bì từ lỗ hậu môn đến lỗ sinh dục = 21,6 ± 3,5.

- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42μm

- Bào nang: Hình cầu, màu nâu đỏ, nhỏ như đầu đinh ghi, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên giao điểm của các đường vân tạo thành hình chữ V (nhìn như mảnh vòng cung).Tỉ số Granek = 3,6± 0,8 

- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khoẻ, dài 27 - 28μ. Gốc kim hút nhỏ và tròn (hình 3). Đầu tuyến trùng luôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao cấu, đuôi tròn ngắn.

          

Hình 2: Phần sau bào nang tuyến trùng Globodera rostochiensis (Wollenweber,

1923) Behrens, 1975 (lỗ hậu môn, lỗ sinh dục, đường vân)

(Nguồn: Tom Powers, 2006)

Hình 3: Hình dạng kim hút của tuyến trùng bào nang

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 và Globodera

pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

(Nguồn: Stone, A. R.,1973)

Lưu ý:

Thông thường số lượng cá thể nghiên cứu phải đảm bảo là 30 (n=30). Trong trường hợp số lượng cá thể ít hơn hoặc chỉ phát hiện duy nhất một cá thể có các đặc điểm phân loại như trên có thể cho phép kết luận là  tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (chỉ áp dụng đối với các đơn vị đã từng giám định được tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975)

 

PHỤ LỤC B (Qui định)

MẪU PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

 

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

Tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975  hoặc

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm

dịch thực vật của Việt Nam

 

1. Tên hàng hoá                            :

2. Nước xuất khẩu                         :

3. Xuất xứ                                     :

4. Phương tiện vận chuyển            :                               Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu                       :

6. Ngày lấy mẫu                            :

7. Người lấy mẫu                          :

8. Tình trạng mẫu                           :

9. Ký hiệu mẫu                              :

10. Số mẫu lưu                             :

11. Người giám định                      :

12. Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về “Quy trình giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam”.

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học:

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

Là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

QCVN 01-37 : 2010/BNNPTNT

 

 

 

 

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA

PHÁT HIỆN SINH VẬT HẠI CÂY THÔNG VÀ CÂY PHI LAO

 

National technical Regulation on Surveillance method of

 pine and casuarina pests

 

 

 

Lời nói đầu

QCVN 01-37 : 2010/BNNPTNT do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây thông và cây phi lao biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tư số  71/2010/TT-BNNPTNT, ngày 10 tháng 12 năm 2010.

 

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA

PHÁT HIỆN SINH VẬT HẠI CÂY THÔNG VÀ CÂY PHI LAO

 

National technical Regulation on Surveillance method of pine

and casuarina pests

 

I. QUY ĐỊNH CHUNG

1.1. Phạm vi điều chỉnh

Quy chuẩn này quy định những nguyên tắc, nội dung, phương pháp, chỉ tiêu chủ yếu điều tra, theo dõi, phát hiện sinh vật hại cây thông, cây phi lao.

1.2. Đối tượng áp dụng

- Quy chuẩn này bắt buộc áp dụng trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ, Kiểm dịch thực vật và các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra phát hiện sinh vật hại cây thông, cây phi lao trên lãnh thổ Việt Nam.

- Áp dụng điều tra phát hiện sinh vật hại bao gồm: sâu, bệnh, động vật hại cây thông và cây phi lao. Điều tra phát hiện các loại sinh vật hại chính trong từng giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây thông và cây phi lao.

- Theo dõi diễn biến số lượng của sinh vật hại chính và sinh vật có ích chính có khả năng điều hoà sinh vật hại cây thông, cây phi lao.

1.3. Giải thích từ ngữ

Trong Quy chuẩn này các thuật ngữ dưới đây được hiểu như sau:

1.3.1. Cây thông/cây phi lao con là thời kỳ cây từ khi gieo, ươm đến khi đạt tiêu chuẩn mang đi trồng (cây giai đoạn vườn ươm);

1.3.2. Rừng thông/phi lao là những khu vực cây thông/phi lao đã được trồng thành rừng;

1.3.3. Thực bì trong rừng thông/phi lao là các loài thực vật (ngoài cây thông/phi lao) mọc trên mặt đất của rừng trồng thông/phi lao;

1.3.4. Sinh vật hại (SVH) là những loài sinh vật mà hoạt động sống của chúng làm giảm số lượng, khối lượng hoặc chất lượng cây thông/phi lao và sản phẩm từ cây thông/phi lao;

1.3.5. Sinh vật hại chính là những loài sinh vật xuất hiện phổ biến và gây hại nặng cây thông/phi lao hàng năm tại địa phương;

1.3.6. Sinh vật hại chủ yếu là những loài sinh vật hại chính cây thông/phi lao, mà tại thời điểm điều tra có mức độ gây hại cao hoặc khả năng lây lan nhanh, phân bố rộng trong điều kiện ngoại cảnh thuận lợi;

1.3.7. Yếu tố điều tra chính là các yếu tố sinh thái đại diện bao gồm: giống, tuổi cây, giai đoạn sinh trưởng của cây, đất, địa hình, hướng đồi;

1.3.8. Khu vực điều tra (ô tiêu chuẩn) là một diện tích rừng trồng thông/phi lao đại diện về các yếu tố sinh thái, được chọn ra để thực hiện các phương pháp điều tra phát hiện, thu thập các thông tin về thực trạng sinh vật hại tại rừng thông/phi lao đó.

1.3.9. Tuyến điều tra được xác định theo một lịch trình đã định sẵn ở các khu vực điều tra nhưng phải đảm bảo thỏa mãn các yếu tố điều tra chính của khu vực điều tra.

1.3.10. Điểm điều tra là điểm được bố trí ngẫu nhiên theo từng yếu tố điều tra, phân bố tương đối đều trong khu vực điều tra.

1.3.11. Mẫu điều tra là cây, bộ phận của cây hay diện tích rừng thông/phi lao được chọn ra để thực hiện điều tra, tính tỷ lệ nhiễm sinh vật hại, mật độ sâu, mức độ bệnh trong công tác điều tra phát hiện sinh vật hại. Số lượng mẫu, cách chọn mẫu phụ thuộc vào đặc điểm của loại sinh vật hại và loại rừng thông/phi lao điều tra.

1.3.11. Mật độ sinh vật hại là số lượng cá thể sinh vật hại trên một đơn vị mẫu điều tra.

1.3.12. Tỷ lệ nhiễm sinh vật hại là số lượng đơn vị mẫu điều tra bị nhiễm sinh vật hại tính theo phần trăm (%) so với tổng số đơn vị mẫu điều tra trong quần thể.

1.3.13. Chỉ số hại là đại lượng đặc trưng cho mức độ hại của từng loài sinh vật hại trên cây thông/phi lao được biểu thị bằng phần trăm (%) và tính theo phân cấp  được quy định.

1.3.14. Sinh vật có ích (SVCI) là thiên địch của các loài sinh vật hại (SVH) trên cây thông/phi lao.

1.3.15. Điều tra định kỳ là hoạt động điều tra thường xuyên của cán bộ bảo vệ thực vật theo một khoảng thời gian ấn định trước trên tuyến điều tra thuộc khu vực điều tra nhằm nắm được diễn biến của sinh vật hại cây thông/phi lao.

1.3.16. Điều tra bổ sung là mở rộng tuyến điều tra vào các thời kỳ xung yếu của cây thông/phi lao và SVH đặc thù của từng vùng sinh thái, nhằm bổ sung số liệu để xác định chính xác thời gian phát sinh, diện phân bố và mức độ gây hại của SVH chủ yếu tại vùng điều tra.

1.3.17. Cành điều tra là cành cấp 1 của cây thông/phi lao; điều tra tất cả các cành phát triển trên độ dài khoảng 50 cm của cành cấp 1 tính từ đầu mút cành trở vào. 

1.3.18. Diện tích nhiễm sinh vật hại là diện tích có mật độ sâu, tỷ lệ bệnh hại đạt từ 50% trở lên theo mức quy định của Quy chuẩn này về mật độ sâu, tỷ lệ bệnh để thống kê diện tích (phụ lục 1a).

II. QUY ĐỊNH VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRA PHÁT HIỆN SINH VẬT HẠI CÂY THÔNG/PHI LAO VÀ THIÊN ĐỊCH CỦA CHÚNG

2.1. Yêu cầu kỹ thuật

2.2.1. Điều tra

- Điều tra phải đảm bảo đầy đủ, chính xác, không để lọt các loại sinh vật hại chính, sinh vật hại chủ yếu; các loài sinh vật có ích chính trên cây thông/phi lao.

- Phát hiện, dự báo những loài sinh vật hại thứ yếu cây thông/phi lao có xu hướng phát triển thành chủ yếu và phân tích nguyên nhân của xu hướng phát triển này.

2.2.2. Xác định diện tích rừng thông/phi lao nhiễm với từng loại sinh vật hại ở các mức: nhẹ, trung bình, nặng, rất nặng-mất trắng và diện tích đã được xử lý theo các biện pháp phòng chống.

2.2.3. Phân tích diễn biến của từng loại dịch hại, các yếu tố sinh thái tác động và nhận định xu hướng phát sinh phát triển, tích luỹ, mức độ gây hại của từng loại sinh vật hại cây thông/phi lao thời gian kế tiếp.

2.2. Thiết bị và dụng cụ điều tra

2.3.1. Dụng cụ điều tra ngoài đồng (chi tiết ở phụ lục 2)

- Vợt côn trùng, khay, khung điều tra, khung hứng phân sâu 1 m², ống nhòm, lúp cầm tay, vồ gỗ (có khối lượng 1.500 – 2000 gr), dụng cụ đào hố, la bàn, máy định vị;

- Thước dây, thước gỗ điều tra, băng giấy dính, băng dính, dao, kéo;

- Sổ ghi chép, bút viết, máy tính bỏ túi, túi nylon các cỡ, túi xách tay điều tra;

- Ống tuýp, hộp petri và hoá chất cần thiết (cồn 70⁰, Formol 5%,…);

- Bẫy đèn (tốt nhất là đèn cực tím, công suất 40 Woat trở lên), bẫy bả

2.3.2. Thiết bị trong phòng

- Kính lúp 2 mắt soi nổi, kính hiển vi, lam, lamen;

- Tủ lạnh, tủ định ôn, máy ôn, ẩm kế tự ghi;

- Máy khuấy, máy lắc, máy rây;

- Máy tính và chương trình phần mềm có liên quan;

2.3.3. Trang bị bảo hộ lao động

- Mũ, ủng, quần áo bảo hộ, áo mưa, găng tay, khẩu trang, kính.

2.3. Phương pháp điều tra

2.4.1. Thời gian điều tra

- Điều tra định kỳ: điều tra 14 ngày/lần (vào các ngày thứ ba, thứ tư tuần thứ 1 và tuần thứ 3 của tháng), theo tuyến điều tra trong khu vực điều tra cố định.

- Điều tra bổ sung (không định kỳ): Tiến hành trước, trong cao điểm xuất hiện gây hại của từng loại sinh vật hại cây thông/phi lao.

2.4.2. Yếu tố điều tra

Chọn đại diện các yếu tố theo đất; địa hình; giống thông/phi lao trồng; tuổi cây; thời kỳ sinh trưởng (thời kỳ ra lá mới, thời kỳ ra hoa kết qủa); các loại sâu bệnh thường xuyên xuất hiện hại thông/phi lao tại địa phương; Số liệu khí tượng ở địa phương (do trạm khí tượng gần nhất cung cấp).

2.4.3. Khu vực điều tra

 -  Khu vực điều tra (ký hiệu là S) có diện tích khoảng 1.000 – 2.500 m², đảm bảo số cây trong khu vực điều tra tối thiểu ≥ 100 cây, đại diện cho các yếu tố điều tra. Thông thường khoảng 10-50 ha rừng thông/phi lao chọn 1 khu vực điều tra. Ghi chép những đặc điểm của khu vực điều tra theo mẫu sau:

2.4.4. Điểm điều tra: Mỗi yếu tố điều tra 10 điểm ngẫu nhiên hoặc nằm ngẫu nhiên trên đường chéo hay tuyến điều tra trên khu vực điều tra (thông thường các điểm điều tra cách nhau 10-20 mét). Điểm điều tra phải nằm cách mép rừng ít nhất 1 hàng cây.

2.4.5. Số mẫu điều tra của một điểm

- Đối với cây thông/phi lao trong vườn ươm, mỗi điểm điều tra 1 khung (kích thước 40 x 50 cm).

- Đối với các loại sinh vật gây hại cành, lá, ngọn, búp non, hoa, quả cây thông/phi lao trên rừng trồng:

  + Nếu rừng thông/phi lao cây còn nhỏ (độ tuổi 1); độ cao tán cây < 2,5 mét, mỗi điểm điều tra 03 cây (cây tiêu chuẩn) và điều tra toàn bộ cây.

  + Nếu rừng thông/phi lao cây đã lớn (độ tuổi 2 trở lên); độ cao tán cây > 2,5 mét, mỗi điểm điều tra 03 cây (cây tiêu chuẩn), mỗi cây chọn 02 cành đối diện nhau (hoặc 05 chùm lá) nằm ở tầng giữa tán cây để điều tra.

- Đối với các loài sinh vật gây hại thân, mỗi điểm điều tra 03 cây (cây tiêu chuẩn), điều tra từ gốc đến độ cao 2 mét trên thân cây.

- Đối với các loài sinh vật gây hại rễ, mỗi điểm điều tra 01 hố (có đường kính 20 cm, độ sâu 20 cm; hố nằm trong khu vực hình chiếu tán cây và cách gốc cây khoảng 20-40 cm.

2.4.6. Cách điều tra

2.4.6.1. Trên thực địa

          Ü Điều tra diễn biến của sinh vật hại trên cây thông và cây phi lao

- Quan sát từ xa đến gần, sau đó điều tra trực tiếp trên cây, sử dụng ống nhòm (đối với các cây tuổi lớn) để xác định đối tượng gây hại hoặc các triệu chứng gây hại. Theo dõi mật độ sâu, phân cấp hại và ghi nhận giai đoạn phát triển của sinh vật hại.

Riêng đối với sâu róm hại thông, có thể áp dụng phương pháp điều tra,  tính mật độ sâu non theo một trong các cách tính gián tiếp sau: 

- Điều tra sâu róm hại thông, mỗi lứa sâu có thể điều tra 06 lần: 01 lần vào pha trứng; 03 lần vào pha sâu non (tuổi 1-2, tuổi 3-4, tuổi 5-6); 01 lần vào pha nhộng và 1 lần vào pha trưởng thành 

- Cách tính mật độ sâu non sâu róm thông gián tiếp theo các cách sau:

    + Đối với sâu non ở tuổi 1 và 2, sử dụng ống nhòm quan sát trên các chùm lá, nếu thấy chùm lá bị bạc thì tại đó là ổ sâu non. Mỗi ổ sâu non được xác định có số lượng từ 250-300 sâu non. 

    + Đối với sâu non từ tuổi 3 trở lên, có thể theo dõi tính mật độ sâu (X) bằng cách sử dụng vồ gỗ đập 3 vồ vào thân cây ở độ cao 70-100 cm và đếm số sâu rơi. Mật độ sâu non trên cây được tính theo công thức:

  X (con/cây) = số lượng sâu róm rơi xuống đất thu được x 3 (hệ số thực nghiệm)

    + Nếu đường kính cây thông quá lớn, đập vồ gỗ không tạo nên độ rung của cây thì theo dõi mật độ sâu róm hại thông gián tiếp qua ô hứng phân rơi của sâu. Đặt khung hứng phân trên mặt đất dưới tán cây ở khu vực điều tra, đếm số lượng viên phân sâu rơi vào khung hứng phân sau 24 giờ. Đổ hết phân sâu đi và tiếp tục theo dõi liên tục trong thời gian 3 ngày đêm vào các ngày không mưa, gió nhẹ.  Tính mật độ sâu non sâu róm thông theo công thức sau:

Trong đó: M_i = mật độ sâu non tuổi i (con/cây)

P_i = Số lượng viên phân trung bình của sâu non tuổi i rơi vào ô hứng phân trong 24 giờ.

d = diện tích hình chiếu tán lá

R_i = Số lượng viên phân bình quân 1 sâu non tuổi i (i = 3-6) thải ra trong 24 giờ;

k = sai số thực nghiệm đối với sâu non tuổi i (được tính bằng tỷ số giữa số lượng viên phân sâu non tuổi i thực tế thải ra và số lượng viên phân sâu non tuổi i thu được trong ô hứng phân).

Qua một số thực nghiệm đã xác định đối với sâu róm loài 4 túm lông Dasychira axutha, k = 1,18-1,2; đối với sâu róm loài Dendrolimus punctatus, k = 1,6-2,0                                                 

Hoặc tính mật độ sâu non sâu róm thông gián tiếp qua tỷ lệ cây có sâu theo công thức Li Tiansheng (1988):

Dựa theo luận thuyết khi quần thể sâu có số lượng lớn thì tỷ lệ cây có sâu hại sẽ cao và ngược lại. Li Tiansheng (1988) sau khi phân tích số liệu của 95 ô tiêu chuẩn với mỗi ô 100 cây, đã xác định được a = 0,02267; b = 0,66787 và r = 0,97. Như vậy, tương quan giữa mật độ sâu non và tỷ lệ cây có sâu là tương quan chặt. Từ đó Li Tiansheng đã xây dựng công thức tính mật độ sâu non sâu róm thông thông qua tỷ lệ cây có sâu như sau

Y = 1- e^-abX        Trong đó Y là tỷ lệ cây có sâu

X là mật độ sâu bình quân (con/cây)

a,b là hằng số thực nghiệm

Y = 1- e^-abX   hoặc e^-abX = 1-Y  ; – abX = ln (1-Y)         

               

Mật độ sâu non sâu róm thông và tỷ lệ cây có sâu tính theo công thức Li Tiansheng như sau:

Như vậy, khi điều tra chỉ cần quan sát xem cây có sâu non của sâu róm thông hay không để tính được giá trị của Y rồi thay vào công thức tính ra mật độ sâu non.

Ü Điều tra tình hình thiên địch của sinh vật hại

Trong quá trình điều tra phát hiện, ngoài quan sát nhận biết các loài thiên địch trong tự nhiên, cần thu thập tối thiểu 30 ổ trứng, 30 sâu non các tuổi, 30 nhộng, 30 trưởng thành của các loài sâu hại chính để đưa về phòng theo dõi ký sinh.

Ü Thu mẫu để theo dõi xác định loài sinh vật

 Đối với các loài sinh vật hại hoặc thiên địch mới, chưa biết, cần phải thu thập mẫu vật đưa về phòng thí nghiệm để theo dõi, giám định hoặc gửi đến các cơ quan chuyên môn để giám định.

2.4.6.2. Trong phòng thí nghiệm

Theo dõi phân tích các mẫu bị sinh vật hại đã thu thập được trong quá trình điều tra, xác định các loài sinh vật ký sinh, tỷ lệ và mức độ bị ký sinh trên các pha phát triển của sâu hại.

2.4.7. Các chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ hại (%):

- Mật độ sinh vật hại (SVH) (con/đơn vị mẫu điều tra)

- Mật độ SVH (con/ đơn vị mẫu điều tra) =

- Tỷ lệ sinh vật hại bị ký sinh (%)

- Mật độ thiên địch (con/cây hoặc con/m²)

- Chỉ số hại (mức độ hại).

Công thức tính chỉ số hại (C %):

Trong đó: n = số đơn vị theo dõi cùng cấp

i = Trị số đại diện cho mỗi cấp hại (từ cấp 1 đến cấp 4)

N= Tổng đơn vị điều tra

4 = Cấp bị hại cao nhất                                                            

- Xác đinh thời kỳ phát dục của sinh vật hại tại thời điểm điều tra (T%), sử dụng công thức tính sau:

Nếu pha phát dục nào chiếm đa số thì xác định sâu hại đang ở thời kỳ phát dục đó.

- Diện tích rừng thông/phi lao nhiễm sinh vật hại

Căn cứ để tính diện tích rừng thông/phi lao nhiễm sinh vật hại (nhẹ, trung bình, nặng) bao gồm:

  + Cơ cấu giống thông/phi lao trồng;

  + Số liệu điều tra của từng yếu tố có liên quan;

  + Mức độ sâu, tỷ lệ bệnh hại thông/phi lao quy định để thống kê diện tích nhiễm, như sau:

Đối với các loại sinh vật hại lá, hoa, quả: Tỷ lệ lá bị hại 25%, tương đương với sâu non có mật độ 50-70 con/cây hoặc 1 ổ trứng/cây hoặc 0,5-1 nhộng cái/trưởng thành cái khoẻ mạnh trên cây;

Đối với các loài sinh vật gây hại thân, cành, ngọn: Tỷ lệ thân, cành, ngọn bị hại 10%;

Đối với các loại sinh vật chích hút gây hại cây, có kích thước nhỏ (rệp, nhện nhỏ, bọ trĩ, bọ phấn,…) tỷ lệ cành lá, chùm lá bị hại là 25%;

Đối với sinh vật gây hại gốc rễ, tỷ lệ cây bị hại 10%

  + Diện tích rừng thông/phi lao nhiễm nhẹ là diện tích rừng có mật độ sâu, tỷ lệ bệnh từ 50 đến 100% mức quy định.

  + Diện tích rừng thông/phi lao nhiễm trung bình là diện tích rừng có mật độ sâu, tỷ lệ bệnh từ 100 đến 200% mức quy định.

  + Diện tích rừng thông/phi lao nhiễm nặng là diện tích rừng có mật độ sâu, tỷ lệ bệnh trên 200% mức quy định.

  + Diện tích rừng thông/phi lao nhiễm rất nặng/mất trắng (dùng để thống kê cuối các đợt dịch) là tổng diện tích rừng cộng dồn do sinh vật làm giảm trên 75% năng suất nhựa hoặc sản lượng gỗ.

  + Tổng diện tích rừng thông/phi lao nhiễm sinh vật hại nào đó là tổng của số diện tích nhiễm nặng, số diện tích nhiễm trung bình, số diện tích nhiễm nhẹ và số diện tích nhiễm rất nặng/mất trắng.

Cách tính diện tích rừng thông/phi lao nhiễm sinh vật hại như sau:

Tổng diện tích rừng thông/phi lao nhiễm một loại sinh vật hại được tính theo công thức sau:

Trong đó:         

- X là tổng diện tích nhiễm 

- N là tổng diện tích rừng thông/phi lao của vùng điều tra

- B là tổng số điểm điều tra

- b số điểm điều tra nhiễm sinh vật hại

Diện tích nhiễm sinh vật hại ở từng mức (nhẹ, trung bình, nặng, mất trắng) được tính theo công thức sau:

Trong đó: X_i là diện tích nhiễm ở mức i (nhẹ, trung bình, nặng hoặc mất trắng);

                  N là diện tích rừng thông/phi lao của vùng điều tra;

                  B là số điểm điều tra

                  C_i là số điểm điều tra nhiễm sinh vật hại ở cấp độ i (nhẹ, trung bình, nặng hoặc mất trắng);

2.4.8. Sổ theo dõi, ghi chép, báo cáo

- Sổ theo dõi sinh vật hại và sinh vật có ích vào bẫy;

- Sổ ghi chép số liệu điều tra sinh vật hại và sinh vật có ích định kỳ, bổ sung của từng loại cây trồng;

- Sổ theo dõi diễn biến diện tích nhiễm sinh vật hại thường kỳ, hàng năm;

- Sổ theo dõi số liệu khí tượng;

- Cơ sở dữ liệu và phần mềm liên quan;

- Các báo cáo thực hiện chung như quy định trong Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng...

III. QUY ĐỊNH VỀ QUẢN LÝ

Quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam này nhằm thống nhất quản lý và tăng cường trách nhiệm của tổ chức, cá nhân trong công tác điều tra phát hiện sinh vật hại, làm cơ sở cho dự báo và phòng trừ các sinh vật hại chính trên cây thông và cây phi lao đạt hiệu qủa, tiết kiệm chi phí, an toàn cho người, động vật, sinh vật có ích và môi trường sinh thái rừng thông/phi lao.

IV. QUY ĐỊNH VỀ TỔ CHỨC THỰC HIỆN

- Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm tổ chức triển khai việc phổ biến, hướng dẫn áp dụng Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia này tới các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra phát hiện sinh vật hại cây thông và cây phi lao trên lãnh thổ Việt Nam.

- Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra phát hiện sinh vật  hại cây thông và cây phi lao trên lãnh thổ Việt Nam, phải nghiên cứu những nội dung yêu cầu của bản Quy chuẩn kỹ thuật để thực hiện đúng các quy định trong Quy chuẩn kỹ thuật này.