Tiêu chuẩn TCVN 7923:2008 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thực phẩm

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7923:2008

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỘ LỌC MÀNG KẺ Ô VUÔNG KỴ NƯỚC

Foodstuffs - Determination of total aerobic count - Hydrophobic grid membrane filter method

Lời nói đầu

TCVN 7923:2008 được xây dựng trên cơ sở AOAC 986.32 Aerobic plate count in foods. Hydrophobic Gric Membrane Filter Method;

TCVN 7923:2008 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỘ LỌC MÀNG KẺ Ô VUÔNG KỴ NƯỚC

Foodstuffs - Determination of total aerobic count - Hydrophobic grid membrane filter method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sản phẩm thực phẩm bằng bộ lọc màng kẻ ô vuông kỵ nước (HGMF).

2. Nguyên tắc

Bộ lọc màng kẻ ô vuông kỵ nước có các màng lọc khuôn mẫu kẻ ô vuông được đóng vật liệu kỵ nước. Các đường kẻ ngăn chặn không cho các khuẩn lạc mọc lan, do đó phân chia bề mặt bộ lọc màng thành các ngăn tách biệt có kích thước xác định bằng nhau. Đếm số lượng các ô vuông có chứa khuẩn lạc và quy đổi sang số có xác suất lớn nhất (MPN) các vi sinh vật, sử dụng công thức đã cho [xem 5.2.1].

3. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Dịch pha loãng Pepton-Tween 80 (PT)

Hòa tan 1,0 pepton và 10,0 g Tween 80 trong 1000 ml nước. Phân phối một thể tích vừa đủ vào các lọ để có 90 ml ± 1 ml hoặc 99 ml ± 1 ml sau khi hấp áp lực 15 min ở 121 ⁰C.

3.2. Thạch trypsin soy-fast green (TSFA)

Hòa tan trong nước 15,0 g trypton, 5,0 phyton (hoặc soyton), 5,0 g NaCl, 0,25 fast freen FCF (CI No. 42053) và 15,0 g thạch rồi pha loãng bằng nước đến 1000 ml. Đun đến sôi. Hấp áp lực 15 min ở 121 ⁰C. Làm nguội đến khoảng từ 50 ⁰C đến 55 ⁰C. Chỉnh pH đến 7,3 ± 0,1 một cách vô trùng. Phân phối các lượng khoảng 18 ml vào các đĩa petri 100 mm x 15 mm. Làm khô bề mặt các đĩa môi trường trước khi sử dụng.

3.3. Dung dịch đệm tris, 1,0 M

Hòa tan 121,1 g tris(hydroxy-metyl)amino metan trong khoảng 500 ml nước. Chỉnh dung dịch đến pH mong muốn bằng HCl đậm đặc và pha loãng bằng nước đến 1000 ml. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ phòng hoặc ở nhiệt độ từ 4 ⁰C đến 6 ⁰C.

3.4. Dung dịch đệm axetat, 1,0 M

Hòa tan 60 ml axit axetic bằng trong khoảng 500 ml nước. Chỉnh dung dịch đến pH mong muốn bằng NaOH 5 M và pha loãng bằng nước đến 1000 ml. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ phòng hoặc ở nhiệt độ từ 4 ⁰C đến 6 ⁰C.

3.5. Dung dịch gốc amylaza

Pha loãng 10 g α-amylaza (Sigma Chemical Co., No. A6814 hoặc loại tương đương) vào 100 ml dung dịch đệm tris, pH bằng 7,0. Để hòa tan được dễ hơn có thể làm ấm đến 35 ⁰C, nếu cần. Lọc qua giấy lọc (4.8) để loại bỏ chất không tan; sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.6. Dung dịch gốc xenlulaza

Pha loãng 10 g xenlulaza (Sigma, No. C0901 hoặc loại tương đương) vào 100 ml dung dịch axetat, pH bằng 5.0. Để hòa tan được dễ hơn có thể làm ấm đến 35 ⁰C, nếu cần. Lọc qua giấy lọc (4.8) để loại bỏ chất không tan; sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.7. Dung dịch gốc diastaza

Pha loãng 10 g diastaza (Sigma. No. A3176 hoặc loại tương đương) vào 100 ml dung dịch đệm tris, pH bằng 7,0. Để hòa tan được dễ hơn có thể làm ấm đến 35 ⁰C, nếu cần. Lọc qua giấy lọc (4.8) để loại bỏ chất không tan; sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.8. Dung dịch gốc hemixenlulaza

Pha loãng 10 g hemixenlulaza (Sigma, No. H2125 hoặc loại tương đương) vào 100 ml dung dịch đệm axetat, pH bằng 5,5. Để hòa tan được dễ hơn có thể làm ấm đến 35 ⁰C, nều cần. Lọc qua giấy lọc (4.8) để loại bỏ chất không tan; sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.9. Dung dịch gốc tripxin

Pha loãng 10 g tripxin vào 100 ml dung dịch đệm tris, pH bằng 7,6. Để hòa tan được dễ hơn có thể làm ấm đến 35 ⁰C, nếu cần. Lọc qua giấy lọc (4.8) để loại bỏ chất không tan; sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.10. Dung dịch gốc lexithinaza (phospholipaza A₂)

Pha loãng dung dịch enzym có bán sẵn (Sigma, No. P6534 hoặc loại tương đương) đến 25 đơn vị/ml bằng dung dịch đệm tris, pH bằng 8.0. Lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.11. Dung dịch gốc pectinaza

Sử dụng dung dịch enzym pectinaza từ Aspergillus niger có bán sẵn, chứa từ 3 đơn vị/mg đến đến 6 đơn vị/mg protein đã được hòa tan trong glyxerol 40% (Sigma, No. P9932). Lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

3.12. Dung dịch gốc proteaza

Sử dụng dung dịch enzym pectinaza từ Bacillus subtilis có bán sẵn, chứa từ 7 đơn vị/mg đến 15 đơn vị/mg protein (Biuret), trong dung dịch lỏng (Sigma, No. P8775 hoặc loại tương đương). Lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm để khử trùng. Bảo quản dung dịch này được 1 tuần ở nhiệt độ 4 ⁰C đến 6 ⁰C hoặc đến 3 tháng ở - 18 ⁰C.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Bộ lọc màng kể ô vuông kỵ nước (HGMF)

Bộ lọc màng có cỡ lỗ 0,45 μm và vật liệu kỵ nước không gây độc được cho vào các ngăn kẻ ô vuông.^[1])

4.2. Các bộ phận của HGMF, có bộ lọc sơ bộ có cỡ lỗ 5 μm để loại bỏ các chất hạt trong quá trình lọc. Một bộ dùng cho một mẫu.¹⁾

4.3. Pipet, dung tích 1,0 ml dùng cho huyết thanh học có chia vạch 0,1 ml, 1,1 ml hoặc 2,2 ml dùng cho sữa. Loại dung tích 5,0 ml dùng cho huyết thanh học có chia vạch 0,1 ml.

4.4. Bộ trọn, nhiều tốc độ hoặc loại tương đương, có thể quay với tốc độ từ 10 000 r/min đến 12 000 r/min, có bình trộn bằng thủy tinh hoặc bằng kim loại dung tích 250 ml có nắp đậy. Mỗi bình dùng cho một mẫu.

4.5. Bơm chân không, nguồn chân không hút nước.

4.6. Bình phân phối hoặc bình chân không.

4.7. Đĩa pipet, 100 x 15 mm

4.8. Giấy lọc, Whatman No. 1 (hoặc loại tương đương).

4.9 Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml.

4.10. Bi thủy tinh.

Bảng 1 - Xử lý bằng enzym đối với thực phẩm

5. Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1. Trứng dạng lỏng

Cân 11 g nguyên liệu trứng cho vào chai có nắp vặn hoặc bình có miệng rộng có nắp đậy bằng thủy tinh vô trùng, trộn kỹ phần mẫu thử bằng thìa hoặc dao vô trùng và chuẩn bị dịch pha loãng 1:10. Thêm 99 ml dịch pha loãng Repton-Tween 80 (3.1) và một thìa đầy các viên bi thủy tinh (4.10) vô trùng. Khuấy mạnh dịch pha loãng 1:10 để đảm bảo trứng được hòa tan hoàn toàn hoặc phân bố đều trong dịch pha loãng bằng cách lắc bình chứa 25 lần, mỗi lần lắc chuyển động lên xuống khoảng 30cm và thời gian không quá 7 s. Cho bọt thoát ra hết. Khi cần chuẩn bị các dãy dịch pha loãng hơn thì chuyển phần mẫu đại diện của dung dịch pha loãng 1:10. Khi cần xử lý bằng enzym (xem Bảng 1), thì trộn 5 ml của dung dịch pha loãng 1:10 với 1 ml dung dịch gốc của enzym (3.9). Ủ ấm trên nồi cách thủy ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C khoảng từ 20 min đến 30 min. Chỉnh hệ số pha loãng bổ sung bằng cách lọc 1,2 ml phần mẫu thử đã xử lý bằng enzym.

5.1.2. Mẫu thử dạng lỏng khác

Trộn kỹ mẫu phòng thử nghiệm đựng trong chai. Để chuẩn bị dịch pha loãng 1:10, chuyển 10 ml phần mẫu thử vào 90 m dịch pha loãng Pepton-Tween 80 một cách vô trùng (3.1). Trộn kỹ bằng cách lắc bình chứa 25 lần, mỗi lần lắc chuyển động lên xuống khoảng 30 cm và thời gian không quá 7 s. Cho bọt khí thoát ra hết. Khi cần chuẩn bị các dãy dịch pha loãng hơn thì chuyển phần mẫu đại diện từ dịch pha loãng 1:10. Khi cần xử lý bằng enzym (xem Bảng 1), thì trộn 5 ml của dịch pha loãng 1:10 với 1 ml dung dịch gốc của enzym (3.9). Ủ ấm trên nồi cách thủy ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C khoảng từ 20 min đến 30 min. Chỉnh hệ số pha loãng bổ sung bằng cách lọc 1,2 ml phần mẫu thử đã xử lý bằng enzym.

5.1.3. Bột từ trứng nguyên quả

Cân 11 g bột trứng cho vào chai có nắp vặn hoặc bình có miệng rộng có nắp đậy bằng thủy tinh vô trùng, trộn kỹ mẫu thử bằng thìa hoặc dao vô trùng và chuẩn bị pha loãng 1:10. Thêm 99 ml dịch pha loãng Pepton-Tween 80 (3.1) và một thìa đầy các viên bi thủy tinh (4.10) vô trùng. Lắc mạnh dịch pha loãng 1:10 để đảm bảo trứng được hòa tan hoàn toàn hoặc phân bố đều trong dịch pha loãng bằng cách lắc mỗi bình chứa 25 lần, mỗi lần lắc chuyển động lên xuống khoảng 30 cm và thời gian không quá 7s. Cho bọt khí thoát ra hết. Khi cần kiểm tra dịch pha loãng 1:10, thì chuẩn bị dịch pha loãng 1:100 và trộn 10 ml dung dịch pha loãng 1:10. Khi cần kiểm tra dịch pha loãng 1:10, thì chuẩn bị dịch pha loãng 1:100 và trộn 10 ml dung dịch pha loãng 1:10 với 1 ml dung dịch gốc trypxin (3.9). Ủ ấm trên nồi cách thủy ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C trong khoảng từ 20 min đến 30 min. Lọc toàn bộ thể tích 11 ml này để kiểm tra dịch pha loãng 1:10.

5.1.4. Các loại thực phẩm khác

Chuyển 10 g phần mẫu thử vào bình trộn vô trùng để chuẩn bị dịch pha loãng 1:10. Thêm 90 ml dịch pha loãng Pepton-Tween 80 (3.1) và trộn trong 2 min ở tốc độ (từ 10 000 r/min đến 12 000 r/min). Chuyển phần mẫu đại diện từ dịch pha loãng 1:10 cho các dây dịch pha loãng hơn khi cần. Nếu cần xử lý bằng enzym (xem Bảng 1), thì lấy 5 ml pha loãng 1:10 trộn với 1 ml dung dịch gốc của enzym. Ủ ấm trong khoảng từ 10 min đến 30 min ở 35 ⁰C đến 37 ⁰C trên nồi cách thủy. Chỉnh hệ số pha loãng bổ sung bằng cách lọc 1,2 ml phần mẫu thử đã được xử lý bằng enzym.

5.2. Phương pháp xác định

5.2.1. Chuẩn bị thử

Chọn dịch pha loãng thích hợp cho phép phân tích, tùy thuộc vào phạm vi đếm mong muốn. Thông thường, độ pha loãng 1:100 là thích hợp, cho phạm vi đếm từ 100/g hoặc 100/ml đến 500 000/g hoặc 500 000/ml. Sử dụng dịch pha loãng 1:10 nếu dự đoán số đếm thấp.

Bật nguồn chân không (xem Hình 1 và Hình 2). Đặt bộ lọc vô trùng trên bình quân chân không. Mở kẹp A. Quay phễu C về phía sau. Đặt HGMF vô trùng trên bề mặt đế D một cách vô trùng. Quay phễu về phía trước. Đóng kẹp bằng cách trượt miệng L của kẹp bằng thép không gỉ trên toàn bộ chiều dài gờ B từ hai phía của phễu C và đáy D và quay cánh tay K theo phương thẳng đứng (khóa).

Hình 1 - Bộ lọc

Hình 2 - Kẹp để giữ bộ lọc

Thêm khoảng 15 ml đến 20 ml vô trùng vào phễu một cách vô trùng. Dùng pipet lấy một lượng yêu cầu của dịch pha loãng cho vào phễu. Nối đầu cuối ống chân không E vào lỗ hút F để lấy dịch lỏng qua bộ lọc sơ bộ G.Thêm tiếp từ 10 ml đến 15 ml nước vô trùng vào phễu và cho chảy qua bộ lọc sơ bộ như trên một cách vô trùng. Khóa hẹp A để tạo chân không trực tiếp vào đáy bộ lọc và hút chất lỏng qua HGMF.

Mở kẹp A. Qua tay chuyển động K của kẹp bằng thép không gỉ vào vị trí mở (một góc xấp xỉ 45⁰) và miệng trượt L rời của các gờ B. Quay phễu C về phía sau. Tháo HGMF một cách vô trùng và đặt lên bề mặt của đĩa TSFA (3.2) đã làm khô sơ bộ. Tránh để lại bọt khí giữa bộ lọc và thạch.

5.2.2. Sữa nguyên liệu, sữa thanh trùng, cream và bột trứng

Ủ ấm mẫu đã chuẩn bị ở 32 ⁰C trong 48 h ± 3h. Các khuẩn lạc có màu xanh khác nhau. Đếm tất cả các ô vuông có một hoặc nhiều khuẩn lạc (các ô dương tính) trừ khi có một khuẩn lạc mọc lan sát ngay các ô, thì được đếm như một ô dương tính. Quy đổi số đếm các ô dương tính sang MPN bằng công thức sau đây:

MPN = {N log_e [N/(N - x)]}

trong đó

N là tổng số các ô vuông;

x là số ô vuông dương tính

Nhân với số nghịch đảo của hệ số pha loãng và ghi lại MPN của tổng số vi khuẩn trên gam hoặc trên mililit sản phẩm.

5.2.3. Trứng dạng lỏng

Ủ ở 32 ⁰C trong ba ngày (72 h ± 3 h) và tiến hành như 5.2.2.

5.2.4. Các loại thực phẩm khác

Ủ ở 35 ⁰C trong 48 giờ ± 3h và tiến hành như 5.2.2.

6. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

- các kết quả thử nghiệm thu được.