Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5561:1991 Thực phẩm - Phương pháp xác định định tính Sacarin1

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5561:1991

THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỊNH TÍNH SACARIN1

Foodstuffs - Method for qualitative identification of sacarin

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định định tính Sacarin trong các loại sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.

1. Lấy mẫu

Theo quy định đối với từng loại sản phẩm cụ thể.

2. Nội dung của phương pháp

Chiết tách Sacarin từ dung dịch loãng của thực phẩm hoặc từ các loại đồ uống bằng etyl axetat. Làm bay hơi dịch chiết. Phần cặn còn lại hoà tan vào hỗn hợp dung môi amonisc - nước – etanola (1:1:2). Sau đó chấm dung dịch này lên bản sắc ký lớp mỏng, so sánh Rf và cường độ huỳnh quang với dung dịch saccarin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng ngắn 254nm.

3. Dụng cụ, hoá chất

3.1. Ngoài các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm ra còn dùng đến:

- Micropipet có chia vạch tới microlit hoặc ống mao quản

- Bình định mức, dung tích 10, 50, 250ml

- Bình chiết, dung tích 250ml.

- Ống nghiệm chia độ, dung tích 250ml.

- Máy cắt quay chân không

- Bình chạy sắc ký

- Tấm kính để tránh lớp mỏng, kích thước 20 x 20cm hoặc dùng bản mỏng tráng sẵn Sil.H

- Máy sấy tóc

- Đèn tử ngoại có bước sóng 254nm

- Bếp cách thuỷ

3.2. Hoá chất

Tất cả các loại hoá chất đều phải là loại tinh khiết.

3.2.1. Axit sunfuric, dung dịch 1:1

3.2.2. Natri hydroxit, dung dịch 50%

3.2.3. Amoniac, dung dịch 25%

3.2.4. Ete dầu hoả có điểm sôi 40-70⁰C

3.2.5. Etyl axetat

3.2.6. Etanola 96%

3.2.7. Silicagen H

3.2.8. Hệ dung môi triển khai

n-butanol-etanola-amoniac-nước theo tỷ lệ thể tích là 40:4:1:9.

3.2.9. Hỗn hợp: amoniac-nước-etanola theo tỷ lệ thể tích là 1:1:2.

4. Chuẩn bị bản mỏng và dung dịch sacarin chuẩn.

4.1. Trộn 30g silicagen H với 75ml nước cất, lắc trong 30 giây để có một dung dịch treo đều. Từ dung dịch treo đều này tráng ra 5 bản mỏng với kích thước 20 x 20cm có độ dầy lớp silicagen H là 0,25mm. Để khô tự nhiên trong phòng thí nghiệm trong 36 giờ. Không được làm khô trong tủ sấy. Không được bảo quản trong bình hút ẩm.

4.2. Chuẩn bị dung dịch sacarin chuẩn

Cân chính xác 10mg Natri saccarinat cho vào bình định mức, dung tích 10ml và định mức bằng hỗn hợp (3.2.9) lắc đều. (1ml dung dịch này chứa 1mg sacarin).

5. Tiến hành thử

5.1. Chuẩn bị mẫu

5.1.1. Đối với đồ uống có cacbon dioxit: đuổi cacbon dioxit bằng cách đun mẫu trên bếp cách thuỷ, hoặc lắc mạnh nhiều lần.

5.1.2. Đồ uống có cồn: lấy 50ml đồ uống cho vào một cốc thuỷ tinh đun trên bếp cách thuỷ để đuổi hết cồn. Sau đó làm nguội phần còn lại, rồi đổ vào bình định mức dung tích 50ml. Dùng nước cất tráng cốc, nước tráng dồn cả vào bình định mức trên. Cuối cùng dùng nước cất định mức tới vạch mức lắc đều.

5.1.3. Đối với thực phẩm ở dạng rắn: nghiền nhỏ mẫu. Cân khoảng 5g mẫu cho vào một cốc thuỷ tinh. Trộn đều lượng cân trên với 200ml nước sôi và giữ trong 2 giờ. Trong thời gian này thỉnh thoảng quấy đều. Sau đó lọc qua giấy lọc gấp nếp vào bình định mức dung tích 250ml. Tráng giấy lọc vài lần bằng nước cất, dùng nước cất định mức tới vạch mức và lắc đều.

5.2. Chiết tách sacarin (điều kiện tiến hành ở phòng mát)

Axit hoá 50ml mẫu thử đã được chuẩn bị ở phần (5.1) bằng 10ml dung dịch axit sunfuric (3.2.1) sau đó cho vào bình chiết, chiết bằng 50ml ete dầu hoả (3.2.4) lắc đều, chờ phân lớp. Thu phần lớp dưới có chứa sacarin sang một bình chiết khác. Tiến hành chiết lần nữa phần còn lại ở bình chiết đầu bằng 1 lượng thuốc thử như trên. Gom các phần có sacarin vào cùng 1 bình chiết rồi thêm vào bình chiết đó 5ml dung dịch Natri hydroxit (3.2.2) và tiến hành chiết tách 2 lần mỗi lần bằng 50ml ethyl axetat (3.2.5). Lọc dung dịch chiết ethyl axetat vào bình cầu của máy cất quay chân không, qua bông thuỷ tinh đã được rửa trước bằng ethyl axetat. Cất chân không cho tới khi còn 2-3ml thì chuyển sang ống nghiệm dung tích 10ml. Tráng rửa bình cầu bằng ethyl axetat, phần tráng này cũng gom vào ống nghiệm. Làm bay hơi dung dịch trong ống nghiệm trên bếp cách thuỷ, tốt nhất là dưới luồng khí nitơ nhẹ. Sau đó hoà tan cặn thu được bằng 2,5ml hỗn hợp dung dịch (3.2.9). Đậy kín ống nghiệm để chạy sắc ký lớp mỏng.

5.3. Tiến hành chấm và chạy sắc ký

5.3.1. Tiến hành chấm sắc ký:

Bản mỏng sau khi đã được chuẩn bị theo mục (4.1), trước khi chấm sắc ký phải cọ sạch lớp silicagen ở cạnh đáy và hai cạnh bên của bản sắc ký với chiều rộng 5mm để tránh hiện tượng mao dẫn. Dùng bút chì nhọn và thước kẻ đánh dấu vạch xuất phát cách mép dưới của bản mỏng 2,5cm. Dùng micropipet chấm 5 điểm dung dịch mẫu thử và dung dịch chất chuẩn: Các điểm cách mép của bản sắc ký và cách nhau 2,5cm. Đường kính mỗi vết chấm không được quá 0,5cm nên mỗi lần chỉ chấm khoảng 1ml, làm khô bằng máy sấy tóc rồi chấm tiếp cho đến khi chấm hết lượng dung dịch cần phải chấm.

Chấm các vết theo thứ tự từ trái sang phải như sau:

2,5ml dung dịch sacarin chuẩn

5ml dung dịch sacarin chuẩn

5ml dung dịch chiết của mẫu thử

5ml dung dịch chiết của mẫu thử đã được pha loãng gấp đôi bằng hỗn hợp dung dịch (3.2.9)

10ml dung dịch sacarin chuẩn

Chấm xong để bản mỏng khô trong không khí.

5.3.2. Tiến hành chạy sắc ký

Dùng một tờ giấy lọc đã được tẩm ướt bằng hỗn hợp dung môi triển khai (3.2.8) phủ xung quanh thành bình phía trong. Sau đó đổ hỗn hợp dung môi triển khai vào bình với độ cao 1cm. Đậy kín nắp bình và để yên 30 phút để có được trạng thái bão hoà dung môi trong bình. Đặt bản mỏng sắc ký đã chấm mẫu và được làm khô vào bình chạy sắc ký, đậy nắp lại để khí quyển trong bình luôn bão hoà dung môi. Khi đường mức dung môi đạt độ cao 10cm (khoảng 1 giờ), nhấc bản mỏng ra, đánh dấu chính xác mức dung môi và làm bay hơi dung môi cho tới khi không nhìn thấy vạch (khoảng 10 phút). Sau đó quan sát bản sắc ký dưới ánh đèn tử ngoại có bước sóng ngắn 254nm. Và khoanh vùng vết sacarin phát huỳnh quang (Rf  0,5).

5.4. Đánh giá sắc ký đó:

So sánh sắc ký đó của mẫu thử với mẫu sacarin chuẩn về:

- Giá trị Rf gần bằng nhau

- Cường độ huỳnh quang như nhau.

Thì có thể kết luận là sắc ký đó của 2 chất giống nhau.