Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5285:1990 Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định hàm lượng cacbonhydrat hòa tan và dễ thủy phân bằng thuốc thử antron

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5285:1990

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDRAT CACBON HÒA TAN VÀ DỄ THỦY PHÂN BẰNG THUỐC THỬ ANTRON

Animal feeding stuffs

Method for determination of soluble and hydrolysable cacbonhydrates content by antrone reagent

Tiêu chuẩn này áp dụng đối với tất cả các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc thực vật; quy định phương pháp xác định hàm lượng hydrat cacbon hòa tan và hydrat cacbon dễ thủy phân bằng thuốc thử antron.

1. Nguyên tắc của phương pháp

Phương pháp dựa trên việc chiết hydrat cacbon hòa tan (đường) từ mẫu thử bằng nước cất ở nhiệt độ 50 - 60^oC, sau đó thủy phân hydrat cacbon dễ thuỷ phân (tinh bột) trong phần còn lại bằng dung dịch axit sunfuric loãng và tiến hành xác định đường trong dịch chiết và dịch thủy phân bằng thuốc thử antron. Dưới tác dụng của axit sunfuric đậm đặc các phân tử đường bị mất nước và tác dụng với antron tạo hợp chất có màu xanh lá cây nhạt. Đo mật độ quang của dung dịch trên máy so màu fek với kính lọc màu đỏ hay trên máy “Spekol” ở bước sóng (625 ± 15) nm.

2. Lấy mẫu

Lấy mẫu để thử theo TCVN 4325-86

3. Dụng cụ và hoá chất

3.1. Dụng cụ

- Máy so màu fek hay “Spekol” hay các loại tương tự;

- Máy cắt mẫu thực vật;

- Máy nghiền mẫu;

- Tủ sấy;

- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0002 g;

- Bếp cách thủy;

- Bếp điện;

- Rây với đường kính lỗ rây 1mm theo TCVN 2230-77;

- Giá ống nghiệm bằng kim loại;

 - Ống nghiệm thuỷ tinh có nút mài, đường kính 2 cm;

- Máy lắc với tần số 200 dao động/phút;

- Cốc đốt dung tích 250 ml có vạch mức 50 - 60 ml;

- Bình định mức có nút mài, dung tích 100; 1000 ml;

- Phiễu lọc sứ;

- Bình Bunden;

- Thiết bị hút chân không;

- Phễu thuỷ tinh đường kính 7 cm;

- ống đong dung tích 100; 250; 500; 1000 ml;

- Bình nón dung tích 150 - 200 ml;

- Pipet dung tích 1, 2, 5, 10, 20, 25ml;

- Bộ định lượng dung tích 10 ml;

- Cối chày sứ;

- Đũa thuỷ tinh;

- Giấy lọc nhanh.

3.2. Hoá chất

- Antron, TK;

- Thioure, TKPT;

- Axit sunfuric đậm đặc (d = 1,84g/ml) TKPT hay TKHH;

- Gluco (khan), TK;

- Kẽm sunfat ngậm bảy phân tử nước ZnSO₄.7 H₂O hay kẽm axetat ngậm 2 phân tử nước Zn(CH₃COO)₂. 2H₂O, TKPT hay TKHH;

- Kali feroxianua ngậm ba phân tử nước K₄Fe(CH)₆. 3 H₂O, TKPT hay TKHH;

- Thuỷ ngân (II) clorua, TKPT hay TKXH;

- Toluen, TKHH;

- Benzen, TKHH;

- Etepetrol, TKPT;

- Canxi clorua khan, TK;

- Nước cất hay nước có độ sạch tương đương.

4. Chuẩn bị thuốc thử và dung dịch

4.1. Tinh chế antron

Antron loại TK cần thiết phải tinh chế lại. Việc tinh chế này được tiến hành trong tủ hút

Hòa tan 10g antron trong 90ml benzen sôi, khuấy nhanh đến khi nhận được dung dịch trong suốt màu nâu. Cho thêm 30 ml ete petrol bằng cách nhỏ từ từ từng giọt ete, vừa nhỏ vừa khuấy. Rót dung dịch lên phễu lọc sứ đã nối với bình Bunden và thực hiện lọc chân không. Những tinh thể antron được kết tinh lại trên phễu, cho bay hơi hết ete trong tủ hút và sau đó đặt vào bình hút ẩm với chất hút ẩm là canxi clorua cho đến khi bay hết mùi dung môi.

Nếu khi hòa tan antron trong Benden mà thu được dung dịch đục thì đó là loại antron có chất lượng không tốt.

Antron đã tinh chế được cho vào lọ nâu, bảo quản trong tủ lạnh.

4.2. Chuẩn bị thuốc thử antron

Trộn 300 ml nước cất với 760 ml axit sunfuric đậm đặc bằng cách rót cẩn thận axit vào nước, vừa rót vừa khuấy. Sau khi làm lạnh dung dịch, cho thêm 1g thioure, 1g antron đã tinh chế và khuấy đến tan hết. Dung dịch nhận được có màu vàng chanh chuyển vào lọ nâu, có nút mài và bảo quản trong tủ lạnh không quá hai tuần.

4.3. Chuẩn bị các dung dịch làm sáng màu

a- Hoà tan 300 g kẽm sunfat hay 230 g kẽm axetat bằng nước cất trong bình định mức dung tích 1000 ml, thêm nước cất đến vạch và trộn đều.

b- Hoà tan 150 g kali feroxianua bằng nước cất trong bình định mức dung tích 1000 ml, thêm nước cất đến vạch mức và trộn đều

4.4. Chuẩn bị dung dịch axit sunfuric 1%:

Trộn 5,6 ml axit sunfuric đậm đặc với nước cất trong bình định mức dung tích 1000 ml, rót axit vào nước, làm lạnh dung dịch đưa thể tích đến vạch mức bằng nước cất và trộn đều.

4.5. Chuẩn bị dung dịch gốc gluco

Hòa tan 0,3 g gluco khan trong bình định mức dung tích 1000 ml bằng nước cất đã đun sôi để nguội. Thêm vào đó vài tinh thể thủy ngân (II) clorua. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh không quá một tháng. Nếu không có thủy ngân (II) clorua thì cho vài giọt toluen và bảo quản trong tủ lạnh không quá một tuần.

4.6. Chuẩn bị thang dung dịch chuẩn:

Thang dung dịch chuẩn được chuẩn bị trong các bình định mức dung tích 100 ml bằng cách rót vào các bình này một lượng dung dịch gốc gluco theo bảng 1, đưa thể tích dung dịch đến vạch mức bằng nước cất và trộn đều.

Bảng 1

5. Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu cỏ khô, rơm rạ, thức ăn ủ chua, thức ăn xanh được cắt thành từng đoạn dài 1-3 cm. Thức ăn củ quả được cắt thành bản mỏng có độ dày 0,8 cm. Đảo đều mẫu đã cắt trên một mặt phẳng sạch và từ những chỗ khác nhau lấy một khối lượng mẫu để sao cho sau khi sấy có được khoảng 100 g. Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 - 65^oC đến khối lượng không đổi (trạng thái khô không khí), nghiền trên máy và sàng qua rây có đường kính lỗ rây 1mm. Phần còn lại trên rây được nghiền lại trong cối sứ, bổ sung vào phần đã sàng và trộn đều.

Mẫu thức ăn hỗn hợp, hạt ngũ cốc, khô dầu, bột từ thân lá cây xanh được nghiền nhỏ và sàng qua rây có đường kính lỗ rây là 1mm.

Mẫu đã chuẩn bị được bảo quản trong bình thủy tinh hay bình polyetylen có nút đậy kín, để ở nơi khô ráo và được sử dụng để tiến hành phân tích.

6. Tiến hành thử

6.1. Chiết hydrat cacbon hòa tan

Cân 0,5 g mẫu ở trạng thái khô không khí (theo mục 5) với độ chính xác đến 0,0002 g chuyển vào bình nón dung tích 150 - 200 ml. Rót vào bình 60 ml nước cất đã đun nóng đến 50 - 60^oC. Đặt bình vào máy lắc và tiến hành lắc với tần số 200 dao động/ phút trong thời gian 15- 20 phút

Lọc dung dịch qua phễu thuỷ tinh với giấy lọc mềm vào bình định mức dung tích 100 ml. Phần còn lại trên giấy lọc được rửa 2-3 lần bằng một lượng nước cất không nhiều. Sau khi làm lạnh đưa thể tích dung dịch đến vạch mức bằng nước cất và lắc đều. Dung dịch nhận được là phần nước chiết ban đầu của hydrat cacbon hòa tan

6.2. Thủy phân hydrat cacbon dễ thủy phân

Phần còn lại trên giấy lọc sau khi chiết hydrat cacbon hòa tan (theo mục 6.1) được chuyển cẩn thận vào cốc thủy tinh chịu nhiệt dung tích 250 ml bằng 50 ml dung dịch nóng axit sunfuric 1%. Đun sôi cốc trên bếp điện trong 5 phút, thỉnh thoảng khuấy đều sao cho không có lượng mẫu bám trên thành cốc. Sau đó lọc ngay phần dịch nóng này qua phễu thuỷ tinh vào bình định mức dung tích 100 ml; tráng cốc bằng nước cất và rót lên phễu. Phần còn lại trên giấy lọc được rửa bằng nước cất. Sau khi làm lạnh, đưa thể tích dịch lọc đến vạch mức bằng nước cất và lắc đều. Dung dịch nhận được trong trường hợp này là dịch thủy phân ban đầu của hydrat cacbon dễ thuỷ phân.

Dịch chiết và dịch thủy phân có thể bảo quản trong tủ lạnh không quá một ngày.

6.3. Làm sáng màu dung dịch

Việc làm sáng màu dịch chiết (mục 6.1) và dịch thủy phân (mục 6.2) được tiến hành bằng cách hút 1-20 ml dung dịch (tùy theo hàm lượng đường) cho vào bình định mức dung tích 100 ml, rót thêm nước cất đến khoảng 2/3 thể tích bình và thêm tiếp 2 ml dung dịch kẽm sunfat hay kẽm axetat, 2ml dung dịch kali feroxianua. Dung dịch trong bình xuất hiện kết tủa vô định hình, thêm nước cất đến vạch mức, trộn đều và để yên trong 20 phút, thỉnh thoảng lắc đều. Sau đó lọc các dung dịch này qua giấy lọc vào bình định mức dung tích 100 ml, bỏ vài giọt đầu.

Nếu mẫu thử có hàm lượng hydrat cacbon thấp thì việc làm sáng màu được tiến hành trực tiếp với dịch chiết và dịch thuỷ phân đầu của mẫu thử mà không cần định mức chúng.

Các dung dịch đã làm sáng màu được bảo quản trong tủ lạnh không quá 1 ngày.

6.4. Tạo màu và đo độ quang

Việc tạo màu đối với dịch chiết, dịch thủy phân của mẫu thử cũng như đối với các dung dịch của thang chuẩn gluco được tiến hành trong các ống nghiệm chịu nhiệt có nút mài.

Dùng pipet với quả bóp cao su cho vào các ống nghiệm 10 ml thuốc thử antron. Sau đó, trong mỗi đợt phân tích thêm tiếp 2 ml dịch chiết đã làm sáng màu vào ống thứ nhất- 2 ml dịch thủy phân đã làm sáng màu vào ống thứ hai - 2 ml lần lượt các dung dịch chuẩn gluco vào ống thứ ba và ống tiếp theo. Đậy nút ống nghiệm lại, cẩn thận lắc đều. Các dung dịch phải trong suốt. Nếu dung dịch nhận được bị đục thì cần thêm tiếp cùng một lượng thuốc thử antron vào tất cả các ống nghiệm nhưng không vượt quá 15 ml cho mỗi ống. Nhanh chóng mở nút, cho các ống nghiệm vào giá kim loại và đặt vào nồi cách thủy đang sôi (nhất thiết phải đang sôi). Tiến hành đun sôi trong 20 phút, trong khi đun dung dịch trong các ống nghiệm xuất hiện màu xanh lá cây. Đậy nút ống nghiệm, làm lạnh dưới vòi nước và sau 30 phút đo mật độ quang của các dung dịch phân tích và dung dịch chuẩn trên máy so màu fek hay “spekol” ở bước sóng (625 ± 15) nm với cuvet có chiều dày 20 nm. Màu của dung dịch đo bền vững trong một ngày.

Dung dịch đối chứng là dung dịch của mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 2 ml dung dịch chuẩn gluco bằng 2ml nước cất, thêm tiếp 10 hay 15 ml thuốc thử antron và đun sôi trong nồi cách thủy trong 20 phút cùng với mẫu phân tích.

Hàm lượng hydrat cacbon trong mẫu thử được xác định theo đồ thị chuẩn - đồ thị được xây dựng dựa vào kết quả đo mật độ quang của các dung dịch chuẩn gluco, với trục hoành là lượng gluco có trong 2 ml dung dịch chuẩn (mg) và trục tung là giá trị mật độ quang tương ứng của chúng.

Giá trị của mật độ quang đo được cần nằm trong khoảng 0,15-0,60. Nếu việc đo nhận được giá trị mật độ quang lớn hơn thì cần pha loãng dung dịch lấy để tạo màu và nếu nhận được giá trị thấp hơn thì cần tăng lượng mẫu thử đem phân tích.

7. Tính toán kết quả

7.1.      Hàm lượng hydrat cacbon hòa tan (đường) trong mẫu thử (X) biểu thị bằng % được tính theo công thức:

Trong đó:

n - Lượng đường trong dịch chiết được tính theo đồ thị chuẩn, tính bằng mg/ 2ml;

V- Thể tích ban đầu chưa làm sáng màu của dịch chiết, tính bằng ml;

V₁ - Thể tích dịch chiết đã làm sáng màu, tính bằng ml;

V₂ - Thể tích ban đầu của dịch chiết lấy để làm sáng màu, tính bằng ml;

V₃ - Thể tích dịch chiết đã làm sáng màu lấy để tạo màu, tính bằng ml;

m - Khối lượng mẫu thử, tính bằng mg;

100 - quy đổi ra tỷ lệ phần trăm.

7.2. Hàm lượng hydrat cacbon để thủy phân (tinh bột) trong mẫu thử (X₁) biểu thị bằng % được tính theo công thức:

Trong đó:

n - Lượng đường trong dịch thủy phân được tính theo đồ thị chuẩn, tính bằng mg/ 2ml;

 V- Thể tích ban đầu chưa làm sáng màu của dịch thủy phân, tính bằng ml;

V₁ - Thể tích dịch thủy phân đã làm sáng màu, tính bằng ml;

V₂ - Thể tích ban đầu của dịch thủy phân lấy để làm sáng màu, tính bằng ml;

V₃ - Thể tích dịch thủy phân đã làm sáng màu lấy để tạo màu, tính bằng ml;

m - Khối lượng mẫu thử, tính bằng mg;

100 - Quy đổi ra tỷ lệ phần trăm;

0,9 - Hệ số chuyển lượng gluco ra tinh bột.

7.3. Kết quả cuối cùng là trị số trung bình của hai lần xác định song song. Sự sai khác cho phép giữa hai lần xác định song song phụ thuộc vào hàm lượng hydrat cacbon có trong mẫu và không được vượt quá trị số nêu ra trong bảng 2. 

Bảng 2

7.4. Hàm lượng hydrat cacbon hòa tan hay hydrat cacbon để thủy phân (X₂) biểu thị bằng % ở dạng vật chất khô được tính theo công thức:

Trong đó :

X hay X₁ - lượng hydrat cacbon hòa tan hay để thủy phân trong mẫu thử ở dạng khô không khí, tính bằng %;

W - độ ẩm của mẫu thử, tính bằng %.