Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5284:1990 Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định hàm lượng caroten

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5284:1990

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAROTEN

Animal feeding stuffs

Method for determination of carotin content

Tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc thực vật và quy định phương pháp xác định hàm lượng Caroten.

1. Nguyên tắc của phương pháp

Phương pháp dựa trên khả năng hòa tan của Caroten trong các dung môi hữu cơ cho mầu vàng, cường độ mầu của dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng Caroten và được đo trên máy quang điện hay quang phổ kế ở bước sóng 440 - 450nm. Vì Caroten tinh thể dễ bị oxy hoá trong không khí nên việc chuẩn bị thang chuẩn thường sử dụng dung dịch kali bicromat hay azobenzen.

Trong dung môi hữu cơ (ete petrol hay xăng) không chỉ Caroten mà còn các sắc tố như diệp lục, xanthofin và các chất khác cũng bị hòa tan. Vì thế cần thiết phải tách chúng khỏi Caroten bằng phương pháp sắc ký hấp phụ.

2. Lấy mẫu

Tiến hành lấy mẫu thử theo TCVN 4325-86.

3. Dụng cụ và hoá chất

3.1. Dụng cụ

- Máy cắt mẫu thực vật, bảo đảm phần cắt nhận được có độ dài 1 - 3cm.

- Máy nghiền mẫu trong phòng thí nghiệm

- Máy so màu quang điện có kính lọc màu xanh ứng với bước sóng 440 - 450nm hay quang phổ kế.

- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,001g;

- Cân kỹ thuật có độ chính xác đến 0,05g;

- Cối chày sứ

- ống đong dung tích 100ml

- Burét dung tích 50ml

- Bình định mức dung tích 100ml; 1000ml;

- Bình nón có nút mài dung tích 100 - 150; 200ml

- Bình Bunden;

- Dụng cụ có hút chân không;

- Cột hấp phụ (ống Allin) đường kính 2 - 4cm;

- Đũa thủy tinh.

3.2. Hoá chất

- Kali bicromat, TKHH;

- Azobenzen, TKHH;

- Ete petrol hay xăng trắng, TK;

- Oxyt nhôm (khan), TK;

- Oxyt canxi (khan), TKPT;

- Natri sunfat (khan), TKPT;

- Natri bicacbonat, TKPT hay TKHH;

- Cồn etylic 96°;

- Nước cất hay nước có độ tinh khiết tương đương;

Chú thích:

Tất cả các công việc tiến hành với ete phải thực hiện trong tủ hút. Khi bảo quản ete, xăng cũng như khi tiến hành thí nghiệm cần cách ly hoàn toàn với những chất dễ cháy và chất nổ.

4. Chuẩn bị thử

4.1. Chuẩn bị oxyt nhôm có độ ẩm 10%

Thêm 100 ml nước cất vào 900g oxyt nhôm khan và trộn đều. Thuốc thử được bảo quản trong lọ có nút mài và được sử dụng để phân tích không sớm hơn một ngày sau lúc chuẩn bị.

4.2. Chuẩn bị cột hấp phụ (ống Allin).

Đặt vào chỗ hẹp nhất của ống Allin một nút bông hút ẩm và đổ lên đó 4 - 5cm chất hấp phụ - oxyt nhôm có độ ẩm 10%. Dùng đũa thủy tinh dồn nhẹ lớp oxyt nhôm xuống, phủ lên đó một miếng bông mỏng và đổ tiếp lên 1 - 2cm natri sunfat khan. Lắp ống hấp phụ vào nút bình Bunden.

Trước khi chạy sắc ký cần đổ một lượng ete petrol lên trên và hút nhẹ bằng chân không cho đến khi ete petrol thấm ướt đều cột hấp phụ, chảy xuống phía dưới và còn lại một ít ở phía trên chất hấp phụ.

4.3. Chuẩn bị dung dịch gốc Kali bicromat

Hoà tan 0,720 g kali bicromat (đã sấy khô đến khối lượng không đổi ở 140°C) trong nước cất và đưa thể tích dung dịch đến vạch mức 1000 ml. 1ml dung dịch này tương ứng theo màu sắc với 0,00416 mg Caroten. Dung dịch được bảo quản với thời hạn một năm sau khi chuẩn bị.

4.4. Chuẩn bị dung dịch gốc azobenzen.

Hòa tan 14,5 mg azobenzen tinh thể trong 100 ml cồn etylic 96°, 1ml dung dịch này tương ứng theo màu sắc với 0,00235 mg Caroten.

4.5. Chuẩn bị thang dung dịch chuẩn.

Dùng burét cho vào các bình định mức dung tích 100 ml lần lượt 10; 20; 30; 40; 50 ml dung dịch gốc Kali bicromat và đưa thể tích đến vạch mức bằng nước cất, cẩn thận trộn đều. Thời hạn sử dụng của các dung dịch chuẩn này không quá 3 tháng.

Đo mật độ quang của các dung dịch chuẩn trên máy so màu với cuvét có chiều dày 20-30 mm ở bước sóng 440 - 450 nm. Dung dịch đối chứng là nước cất.

Từ những kết quả mật độ quang thu được tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn với trục hoành là thể tích của dung dịch gốc Kali bicromat lấy để chuẩn bị thang chuẩn và trục tung là giá trị mật độ quang tương ứng của các dung dịch chuẩn.

5. Tiến hành thử

5.1. Mẫu cỏ khô, rơm rạ được cắt bằng máy hay bằng kéo thành từng đoạn có chiều dài 1 - 3 cm, trộn đều trên mảnh nilon và sau đó từ những chỗ khác nhau lấy một lượng mẫu 100 g và nghiền nhỏ trên máy nghiền. Những loại bột từ thân lá cây xanh có kích thước hạt 1-2 mm được phân tích ngay không cần phải nghiền.

Từ lượng mẫu đã trộn đều, cân 1- 2 g mẫu với độ chính xác đến 0,05 g chuyển vào cối sứ và nghiền nát cẩn thận với 5-10 g cát hay thủy tinh giã nhỏ.

5.2. Mẫu thức ăn giàu nước (thức ăn xanh, củ quả, thức ăn ủ) được cắt nhỏ, đảo đều trên mảnh nilon và từ nhiều chỗ khác nhau cân một lượng 2 - 4 g mẫu với độ chính xác đến 0,05 g cho vào cối sứ đã chứa sẵn 5-10 g cát hay thủy tinh giã nhỏ. Nếu mẫu là thức ăn ủ chua hay ủ héo cho thêm một lượng xô đa bằng đầu mũi dao nhỏ. Nhanh chóng nghiền nát hỗn hợp trong cối sứ với thời gian không ít hơn 3 - 4 phút. Để nhận được khối lượng rời, đã khử nước của mẫu cần thêm vào đó 15-25 g natri sunfat khan, đảo đều.

5.3. Chuyển cẩn thận lượng mẫu đã được xử lý theo mục 5.1, 5.2 ở trên vào bình nón dung tích 100-150ml và rót vào đó 20-25ml ete petrol. Rửa cối chày sứ vài lần bằng một lượng không nhiều ete petrol và chuyển cả vào bình nón trên. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều đậy nắp bình lại để yên 20 - 24 giờ trong bóng tối.

5.4. Sau thời gian chiết suất, cẩn thận chắt dịch chiết lên cột sắc ký đã chuẩn bị sẵn (theo mục 4.2) và tiến hành lọc trong chân không yếu. Rửa phần còn lại trong bình nón bằng một lượng không nhiều ete petrol và lại đổ lên cột. Việc rửa này được tiến hành vài lần đến khi dung dịch chảy ra trở nên không màu.

5.5. Đo thể tích dung dịch ete petrol có chứa Caroten thu được từ bình Buđen bằng ống đong hay xi lanh. Sau đó đo mật độ quang của dung dịch trên máy so màu với cuvét có chiều dày 20-30 mm ở bước sóng 440 - 450 nm. Dung dịch đối chứng là ete petrol.

Trong quá trình phân tích một lượng đáng kể Caroten bị mất đi do tác dụng mạnh của ánh sáng và sự phá hủy của không khí vì thế việc đo mật độ quang của dịch chiết cần tiến hành trong khoảng thời gian ngắn nhất.

5.6. Nếu mật độ quang của dịch chiết lớn hơn 0,6 thì cần pha loãng bằng cách lấy chính xác 25 ml dịch chiết này cho vào bình định mức 50 ml và thêm tiếp ete petrol đến vạch mức. Kết quả trong trường hợp này được nhân lên gấp đôi.

6. Tính toán kết quả.

6.1. Hàm lượng Caroten (X) biểu thị bằng mg trong 1kg mẫu được tính theo công thức

Trong đó:

a - Lượng tương đương với dung dịch gốc tìm thấy trên đồ thị chuẩn, tính bằng ml.

0,00416 - Hệ số chuyển 1ml dung dịch gốc kali bicromat ra lượng tương đương với Caroten, mg;

V - Thể tích dịch lọc của mẫu thử sau khi qua cột hấp phụ, tính bằng ml;

b - Thể tích của dung dịch chuẩn, tính bằng ml;

m - Khối lượng của mẫu thử, tính bằng g;

1000 - Hệ số chuyển về 1kg mẫu.

6.2. Kết quả cuối cùng là trị số trung bình của hai lần xác định song song. Sự sai khác cho phép giữa 2 lần xác định song song (d,) phụ thuộc vào hàm lượng Caroten có trong mẫu và không được vượt qua trị số ghi trong bảng sau:

6.3. Hàm lượng Caroten (X1) biểu thị bằng mg trên 1 kg ở dạng vật chất khô được tính theo công thức:

Trong đó:

X - Hàm lượng Caroten trong 1 kg mẫu ở dạng khô không khí tính bằng mg;

W - Độ ẩm của mẫu, tính bằng %.