Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 10695:2015 EN 12742:1999 Nước rau, quả-Xác định hàm lượng axit amin tự do-Phương pháp sắc ký lỏng

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10695:2015

EN 12742:1999

NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Fruit and vegetable juices - Determination of free amino acids content - Liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 10695:2015 hoàn toàn tương đương EN 12742:1999;

TCVN 10695:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quả biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN TỰ DO - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Fruit and vegetable juices - Determination of free amino acids content - Liquid chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng axit amin tự do trong nước rau, quả và các sản phẩm liên quan.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Ký hiệu

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các ký hiệu sau:

c là nồng độ chất;

r là nồng độ khối lượng;

g là gia tốc trọng trường (9,81 m/s²).

4. Nguyên tắc

Axit amin được tách ra trên cột sắc ký trao đổi cation bằng cách rửa giải từng bước với một dãy dung dịch đệm lithi xitrat có nồng độ phân tử gam và các giá trị pH khác nhau. Sau phản ứng màu với ninhydrin, các axit amin được định lượng bằng quang phổ ở bước sóng 570 nm (hoặc 440 nm đối với prolin).

5. Thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 1 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

5.2. Dung dịch đệm dùng cho dịch rửa giải axit amin

Chuẩn bị dung dịch đệm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Có thể sử dụng dung dịch đệm lithi xitrat có bán sẵn, có giá trị pH và nồng độ phân tử ion lithi khác nhau.

Nồng độ phân tử và các giá trị pH của dung dịch đệm có thể khác nhau theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị (ví dụ: chiều dài và đường kính của cột phân tích và loại resin).

Do không thể đưa ra các chi tiết chính xác đối với việc chuẩn bị dung dịch đệm khác nhau nên việc mô tả dung dịch đệm được nêu trong Phụ lục B chỉ để tham khảo khi sử dụng tiêu chuẩn này.

5.3. Dung dịch lithi hydroxit, c(LiOH) = 0,2 mol/l đến 0,4 mol/l

Ví dụ về việc chuẩn bị dung dịch này để phục hồi cột được nêu trong Phụ lục B.

5.4. Thuốc thử màu

Ninhydrin trong dung dịch 2-methoxyethanol và đệm natri axetat. Độ ổn định của hỗn hợp này thay đổi nhiều và trong khoảng từ vài ngày đến vài tuần.

Ví dụ về việc chuẩn bị dung dịch dùng để tạo màu được nêu trong Phụ lục B.

5.5. Đệm lithi xitrat, (pH = 2,00 đến 2,20) đối với mẫu pha loãng

Ví dụ về việc chuẩn bị dung dịch đệm này được nêu trong Phụ lục B.

5.6. Dung dịch chuẩn axit amin

Cân từng phần axit amin sao cho sau khi pha loãng thích hợp, mức độ hấp thụ trong máy phân tích nằm trong dải tuyến tính đối với từng axit amin. Điều này có lợi cho việc sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ tương tự được dự kiến trong mẫu. Nên dùng vật liệu chuẩn1) đã được chứng nhận đối với qui trình này. Ví dụ về việc chuẩn bị dung dịch thử axit amin này được nêu trong Phụ lục B.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

6.1. Máy phân tích axit amin, có kích thước cột như sau:

9 mm x 500 mm, 6 mm x 200 mm, 4,6 mm x 200 mm hoặc 270 mm, 4 mm x 200 mm, 4 mm x 100 mm hoặc 3,2 mm x 140 mm.

Cột có thể được làm bằng thủy tinh hoặc thép. Các cột khác nhau, như mô tả ở trên, cho độ lệch đáng kể về độ phân giải pic và thời điểm phân tích.

6.2. Resin sắc ký (trao đổi cation)

Resin chỉ là tên thương mại và được qui định thích hợp đối với các máy phân tích khác nhau có bán sẵn, ví dụ: Durrum2) DC-6a, Biotronik²⁾ BTC 3118, Biotronik²⁾ BTC 2710, LKB Ultropac²⁾ II, LKB Ultropac²⁾ 8,6300/7300 Beckman²⁾. Tiền cột cũng có bán sẵn, có dải của các resin này để loại bỏ các vết muối amoni từ dung dịch đệm và hỗ trợ để kéo dài thời gian sử dụng của cột phân tích (ví dụ: Durrum²⁾ C-3, Biotronik²⁾ BTC-F, LKB Ultropac²⁾ I).

6.3. Máy ly tâm, có thể tạo ra lực ly tâm là 4 000 g ở ống ly tâm 6.4.

CHÚ THÍCH: Tốc độ quay cần để cho gia tốc ly tâm chính xác có thể tính được theo Công thức sau:

a = 11,18 x r x (n/1000)²                                                                                     (1)

Trong đó:

a là gia tốc ly tâm;

r là bán kính của máy ly tâm đo được từ điểm tâm (trục ly tâm) đến đáy của ống ly tâm khi quay, tính bằng xentimet (cm);

n là tần suất quay trên phút.

6.4. Ống ly tâm

6.5. Bộ lọc màng, có bộ lọc bằng xyranh thấm nước không vô trùng với cỡ lỗ 0,45 µm.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Thông thường các mẫu không cần xử lý trước và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào thể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa vào lượng mẫu đã cân và hệ số pha loãng, các kết quả có thể được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử.

Trộn kỹ mẫu đục trước khi pha loãng.

Trộn mẫu nước quả với dung dịch đệm loãng (5.5) và dung dịch chuẩn nội [c(không-leuxin hoặc không valin) = 1 mmol/l, như mô tả trong Phụ lục B]. Ly tâm dung dịch này ở 4 000 g trong 15 min. Cuối cùng làm trong mẫu bằng cách cho dung dịch chảy qua bộ lọc xyranh (6.5) và mẫu phù hợp để phân tích.

CHÚ THÍCH: Độ pha loãng yêu cầu của mẫu phụ thuộc vào thành phần mong muốn của nước quả và lượng mẫu bơm. Tuy nhiên, thông thường độ pha loãng trong khoảng từ 1:1 đến 1:10. Đối với nước cam, độ pha loãng thích hợp được sử dụng là 1:10. Trong trường hợp đặc biệt, ví dụ: nước anh đào nên sử dụng hai độ pha loãng riêng biệt (ví dụ: 1:5 và 1:20). Độ pha loãng này cũng phải thay đổi phụ thuộc vào nồng độ của axit amin khác nhau (ví dụ: trong trường hợp anh đào có hàm lượng asparagin rất cao).

Lượng mẫu được bơm thường thay đổi theo các hệ thống khác nhau và cũng phụ thuộc vào độ pha loãng của mẫu. Tuy nhiên, thường sử dụng lượng mẫu bơm từ 20 µl đến 300 µl.

7.2. Qui trình thử nghiệm

Tiến hành tách axit amin theo các điều kiện cụ thể của thiết bị. Rửa giải bằng 4 đến 6 dung dịch đệm khác nhau (5.2) có các giá trị pH khác nhau và dải ion có thể được sử dụng. Ví dụ dung dịch đệm ban đầu thường có nồng độ ion lithi c(LiOH) = 0,10 mol/l và pH 2,94 (dung dịch đệm A trong Phụ lục B). Nồng độ dung dịch đệm này sẽ tăng đến c(LiOH) = 1,40 mol/l và dung dịch đệm này có pH 3,65 (dung dịch đệm E trong Phụ lục B). Giữ cột ở nhiệt độ không đổi trong khoảng từ 30 °C đến 80 °C tùy thuộc vào bước tiến hành rửa giải được thực hiện và hệ thống thực được sử dụng. Chọn pH, phân tử lithi, thời điểm chạy dung dịch đệm khác nhau và nhiệt độ cột để cho các điều kiện tách tối ưu mà có thể thay đổi từ phòng thử nghiệm này sang phòng thử nghiệm khác.

Phục hồi cột bằng dung dịch lithi hydroxit (c(LiOH) = 0,2 mol/l đến 0,4 mol/l) giữa các mẫu và trước khi cân bằng lại cột trong quá trình chạy dung dịch đệm ban đầu.

Nhiệt độ cột tại thời điểm phản ứng tạo màu với ninhydrin, thường trong khoảng từ 100 °C đến 130 °C. Sản phẩm phản ứng được đo bằng máy đo phổ ở bước sóng 570 nm đối với tất cả axit amin ngoại trừ prolin được phát hiện ở bước sóng 440 nm.

8. Tính kết quả

Tiến hành hiệu chỉnh hệ thống sử dụng dung dịch chuẩn axit amin, ví dụ: như mô tả trong Phụ lục B.

Sử dụng qui trình chuẩn nội và diện tích pic để định lượng từng axit amin. Nếu mẫu cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.

Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân, tính bằng mmol trên lit (mol/l).

9. Độ chụm

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục A.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đó là:

- đối với axit amin có mặt ở nồng độ thấp c < 0,1="" mmol/l:="">r = 0,013 mmol/l;

- đối với axit amin có mặt ở nồng độ cao c < 0,1=""> r = 2,8 sr;

Trong đó:

s_r = 0,0026 + 0,0132 x c[mmol/l].

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Các giá trị đó là:

- đối với axit amin có mặt ở nồng độ thấp c < 0,1="" mmol/l:="">R = 0,019 mmol/l;

- đối với axit amin có mặt ở nồng độ cao c < 0,1="" mmol/l:="">R = 2,8 s_R;

Trong đó:

s_R = 0,007 + 0,0473 x c[mmol/l].

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- ngày và kiểu quy trình lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

- độ lặp lại của phương pháp đã được đánh giá;

- các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các thông số sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu để đánh giá phương pháp, xem Thư mục Tài liệu tham khảo). Phép thử do Viện Max von Pettenkofer của Tổ chức Y tế liên bang, Cục hóa thực phẩm, Berlin, Đức tổ chức thực hiện.

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm              1987

Số lượng các phòng thử nghiệm                                   2

Bảng A.1 - Nước cam

	Giá trị trung bình  (mmol/l)	Độ lệch chuẩn lặp lại sr (mmol/l)	Giới hạn lặp lại r (mmol/l)	Độ lệch chuẩn tái lập sR (mmol/l)	Giới hạn tái lập R (mmol/l)
Axit aspartic	2,06	0,02127 (f = 36)	0,06	0,09081 (f = 44)	0,26
Threonin	0,19	0,00517 (f = 43)	0,015	0,01352 (f = 52)	0,04
Serin	1,67	0,01804 (f = 36)	0,05	0,05981 (f = 44)	0,17
Axit glutamic	0,82	0,01336 (f = 39)	0,04	0,06045 (f = 47)	0,17
Prolin	10,38	0,09834 (f = 33)	0,28	0,6273 (f = 40)	1,78
Glycin	0,25	0,00742 (f = 47)	0,02	0,02094 (f = 57)	0,06
Alanin	1,31	0,01504 (f = 36)	0,04	0,05862 (f = 44)	0,17
Valin	0,23	0,00664 (f = 46)	0,02	0,01082 (f = 55)	0,03
Methionin	0,028	0,00136 (f = 47)	0,004	0,00749 (f = 56)	0,02
Iso-Leucin	0,065	0,00519 (f = 47)	0,015	0,00693 (f = 57)	0,02
Leucin	0,059	0,00511 (f = 47)	0,014	0,00990 (f = 57)	0,03
Tyrosin	0,12	0,00556 (f = 39)	0,016	0,01172 (f = 47)	0,03
Phenyl alanin	0,25	0,00652 (f = 43)	0,02	0,02196 (f = 52)	0,06
Axit amino butyric	3,63	0,04450 (f = 40)	0,13	0,2028 (f = 49)	0,57
Ethanolamin	0,38	0,01945 (f = 33)	0,06	0,04947 (f = 40)	0,14
Amoni	Độ lệch tính theo giá trị trung bình
Ornithin	0,048	0,00433 (f = 32)	0,012	0,00692 (f = 39)	0,02
Lysin	0,27	0,00971 (f = 50)	0,03	0,03360 (f = 60)	0,10
Histidin	0,10	0,00520 (f = 47)	0,015	0,01258 (f = 57)	0,04
Arginin	4,24	0,06826 (f = 43)	0,19	0,1915 (f = 52)	0,54
Asparagin	2,80	0,04439 (f = 43)	0,13	0,1585 (f = 52)	0,45
Glutamin	Độ lệch tính theo giá trị trung bình.
f = bậc tự do.

Bảng A.2 - Nước táo

	Giá trị trung bình  (mmol/l)	Độ lệch chuẩn lặp lại sr (mmol/l)	Giới hạn lặp lại r (mmol/l)	Độ lệch chuẩn tái lập sR (mmol/l)	Giới hạn tái lập R (mmol/l)
Axit aspartic	0,77	0,01239 (f = 43)	0,04	0,04190 (f = 52)	0,12
Threonin	0,064	0,00449 (f = 43)	0,013	0,00644 (f = 52)	0,018
Serin	0,20	0,00493 (f = 39)	0,014	0,01087 (f = 47)	0,03
Axit glutamic	0,27	0,01009 (f = 35)	0,03	0,03614 (f = 42)	0,10
Prolin	0,10	0,00563 (f = 35)	0,016	0,02083 (f = 42)	0,06
Glycin	0,033	0,00390 (f = 46)	0,011	0,00551 (f = 55)	0,016
Alanin	0,31	0,00570 (f = 35)	0,016	0,01244 (f = 42)	0,04
Valin	0,047	0,00468 (f = 43)	0,013	0,01316 (f = 52)	0,04
Methionin	<>	Giá trị quá nhỏ
Iso-Leucin	0,024	0,00468 (f = 46)	0,013	0,00595 (f = 55)	0,017
Leucin	- 0,01	Giá trị quá nhỏ
Tyrosin	- 0,01	Giá trị quá nhỏ
Phenyl alanin	0,039	0,00583 (f = 47)	0,016	0,01513 (f = 57)	0,043
Axit amino butyric	0,15	0,00631 (f = 43)	0,018	0,01887 (f = 52)	0,05
Ethanolamin	Độ lệch tính theo giá trị trung bình.
Amoni	Độ lệch tính theo giá trị trung bình.
Ornithin	<>	Giá trị quá nhỏ
Lysin	- 0,01	Giá trị quá nhỏ
Histidin	- 0,01	Giá trị quá nhỏ
Arginin	- 0,01	Giá trị quá nhỏ
Asparagin	3,81	0,05753 (f = 39)	0,16	0,41180 (f = 47)	1,17
Glutamin	<>	Giá trị quá nhỏ
f = bậc tự do.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Chi tiết về các điều kiện đặc trưng và thuốc thử sử dụng trong phân tích axit amin tự do của nước rau quả

B.1. Yêu cầu chung

Phụ lục này đưa ra các ví dụ về các dung dịch được sử dụng để phân tích nước rau, quả. Phụ lục này chưa liệt kê hết danh mục các dung dịch và có thể sử dụng các dung dịch khác. Nên tham khảo sổ tay hướng dẫn của nhà sản xuất để xác định các điều kiện tốt nhất cho hệ thống cụ thể.

B.2. Dung dịch đệm cần cho bước pha loãng axit amin (xem 5.2)

B.2.1. Dung dịch đệm A [pH = 2,94; c(LiOH) = 0,10 mol/l]

Hòa tan 9,4 g trilithi xitrat tetrahydrat, 7,4 g axit xitric ngậm một phân tử nước trong 500 ml nước. Thêm vào dung dịch này 30 ml metanol và 5 ml axit clohydric [c(HCl) = 10 mol/l]. Pha loãng bằng nước đến khoảng 900 ml và điều chỉnh pH đến 2,94 (20 °C) bằng axit clohydric. Thêm nước đến 1 lít ở nhiệt độ 20 °C. Nên bảo quản dung dịch đệm này bằng phenol hoặc bằng 3 giọt đến 4 giọt dung dịch pentachlorophenol trong etanol (r = 5,0 mg/l).

Kiểm tra pH của dung dịch trong ngày tiếp theo và điều chỉnh đến pH 2,94, nếu cần.

CẢNH BÁO: Phenol và pentachlorophenol là chất độc và nên tiến hành trong tủ hút, sử dụng các cảnh báo thông thường đối với các chất độc (đeo găng tay, đeo kính an toàn.v.v.).

B.2.2. Dung dịch đệm B, [pH = 3,19; c(LiOH) = 0,12 mol/l]

Chuẩn bị 1 lít dung dịch đệm này, sử dụng các thuốc thử sau:

11,3 g trilithi xitrat tetrahydrat, 6,0 g axit xitric ngậm một phân tử nước, 50 ml metanol và 6 ml axit clohydric [c(HCl) = 10 mol/l].

Tương tự qui trình mô tả ở trên, chuẩn bị và điều chỉnh dung dịch đến pH 3,19 và thêm nước đến vạch. Sau đó, bổ sung chất bảo quản vào dung dịch đệm như mô tả ở trên đối với dung dịch đệm A.

B.2.3. Dung dịch đệm C, [pH = 3,54; c(LiOH) = 0,18 mol/l]

Chuẩn bị 1 lít dung dịch đệm này sử dụng các thuốc thử sau:

16,9 g of trilithi xitrat tetrahydrat, 1,8 g xitric ngậm một phân tử nước và 9 ml axit clohydric [c(HCl) = 10 mol/l].

Tương tự qui trình mô tả ở trên, chuẩn bị và điều chỉnh dung dịch đến pH 3,54 và thêm nước đến vạch. Sau đó, bổ sung chất bảo quản vào dung dịch đệm như mô tả ở trên đối với dung dịch đệm A.

B.2.4. Dung dịch đệm D, [pH = 4,23; c(LiOH) = 0,40 mol/l]

Chuẩn bị 1 lít dung dịch đệm này sử dụng các thuốc thử sau:

18,8 g of trilithi xitrate tetrahydrat, 8,5 g lithi clorua, 1,5 g axit boric và 8 ml axit clohydric [c(HCl) = 10 mol/l].

Tương tự qui trình mô tả ở trên, chuẩn bị và điều chỉnh dung dịch đến pH 4,23 và thêm nước đến vạch. Sau đó, bổ sung chất bảo quản vào dung dịch đệm như mô tả ở trên đối với dung dịch đệm A.

B.2.5. Dung dịch đệm E, [pH = 3,65; c(LiOH) = 1,40 mol/l]

Chuẩn bị 1 lít dung dịch đệm này sử dụng các thuốc thử sau:

5,0 g of trilithi xitrat tetrahydrat, 57,0 g lithi clorua, 4,0 g axit boric và 2 ml axit clohydric [c(HCl) = 10 mol/l].

Tương tự qui trình mô tả ở trên, chuẩn bị và điều chỉnh dung dịch đến pH 3,65 và thêm nước đến vạch. Sau đó bổ sung chất bảo quản vào dung dịch đệm như mô tả ở trên đối với dung dịch đệm A.

B.3. Dung dịch lithi hydroxit để phục hồi cột sắc ký, [c(LiOH) = 0,3 mol/l] (xem 5.3).

Hòa tan 12,6 g lithi hydroxit trong 1 lít nước.

B.4. Dung dịch thuốc thử màu (xem 5.4)

Chuẩn bị dung dịch đệm natri axetat (pH = 5,50) như sau:

Bổ sung 800 ml axit axetic băng vào 3 l nước (F1) = 99,8 %). Trộn kỹ và thêm từ từ 2 720 g natri axetat trihydrat. Làm ấm cẩn thận dung dịch để natri axetat hòa tan hết. Chỉnh pH của dung dịch này đến 5,50 ± 0,03 (20 °C) bằng axit axetic và thêm đến vạch 5 l ở nhiệt độ 20 °C.

Chuẩn bị dung dịch ninhydrin (thuốc thử màu) như sau:

Trong bình định mức 1 lít ban đầu (thủy tinh nâu) trộn 750 ml 2-methoxyetanol với 250 ml dung dịch đệm natri axetat (đã cho ở trên). Dung dịch được lọc qua G1-hỗn hợp thủy tinh và thêm 20 g ninhydrin. Sử dụng dòng khí nitơ để hòa trộn dung dịch cho đến khi ninhydrin hòa tan. Để chuẩn bị hỗn hợp cũng thêm 5 ml dung dịch titan (III) clorua [w(TiCl₃) = 15 %] trong axit clohydric [w(HCl) = 10 %] hoặc 0,7 g hydrindantin để ổn định dung dịch.

Dung dịch này có thể thay đổi nhiều từ vài ngày đến vài tuần.

B.5. Mẫu đệm lithi xitrat (xem 5.5), [pH = 2,20; c(LiOH) = 0,10 mol/l]

Chuẩn bị 1 lít dung dịch đệm này sử dụng các thuốc thử sau:

9,4 g trilithi xitrat tetrahydrat, 7,4 g xitric ngậm một phân tử nước, 5,0 ml 2,2'-thiodiethanol (bis-(2-hydroxyethyl)-sulfit), và 5 ml axit clohydric [c(HCI) = 10 mol/l].

Tương tự như qui trình mô tả ở trên đối với dung dịch A, chuẩn bị và điều chỉnh pH của dung dịch đến 2,20 và thêm nước đến vạch. Sau đó, bổ sung chất bảo quản vào đệm như mô tả chi tiết ở trên đối với đệm A.

B.6. Chuẩn bị dung dịch thử axit amin

B.6.1. Yêu cầu chung

Các giá trị nồng độ tính bằng mmol/l axit amin và các giá trị khác được đưa ra trong ngoặc có thể phù hợp nhất với mục đích sử dụng.

B.6.2. Dung dịch chuẩn A

Chứa amoniac (c = 2,0), ethanolamin (c = 1,0) và các axit amin sau:

axit aspartic	(1,5)	threonin	(1,0)	serin	(1,5)	axit glutamic	(1,5)
prolin	(6,0)	glycin	(1,0)	alanin	(1,5)	valin	(1,0)
methionin	(1,0)	iso-leucine	(1,0)	leucin	(1,0)	tyrosin	(1,0)
phenylalanin	(1,0)	axit gamma-amino-n-butyric			(1,5)	ornithin	(1,0)
lysin	(1,0)	histidin	(1,0)	arginin	(1,0)

B.6.3. Dung dịch chuẩn B

Chứa các axit amin sau: asparagin (3,0) và glutamin (1,0).

B.6.4. Dung dịch chuẩn C

Chứa 1 mmol/l của chất không-leucin hoặc không-valin được dùng làm chất chuẩn nội.

Khi bảo quản ở - 18 °C dung dịch bền trong vài tháng.

Đối với việc hiệu chuẩn thiết bị, trộn ba dung dịch chuẩn A, B, C mỗi dung dịch 1 ml và thêm dung dịch đệm (xem 5.5) đến 10 ml.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 5725:19861), Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm của phương pháp thử - Xác định độ lặp lại và độ tái lập đối với phương pháp thử chuẩn bằng phép thử liên phòng thử nghiệm).

Moore, S. and Stein, W.H. Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins. J. Biol. Chem. (1951), 192, 663-681.

Determination of free amino acids: No. 57,1989. Analyses [Collection]/Intemational Federation of Fruit Juice Producers. Loose-leaf edition, as of 1989. Zug: Swiss Fruit Union.