Tiêu chuẩn TCVN 5162:2008 Xác định hàm lượng vitamin B1 trong thực phẩm

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5162:2008

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs – Determination fo vitamin B₁ by high performance liquid chromatography (HPLC)

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định vitamin B₁ trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hàm lượng vitamin B₁ là khối lượng thiamin tổng số bao gồm các dẫn xuất đã tách phospho.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Thiamin được chiết ra khỏi thực phẩm sau khi thủy phân bằng axit rồi tách phospho sử dụng cách xử lý bằng enzym và định lượng bằng HPLC có dẫn xuất sau cột hoặc trước cột với thiocrom [1] đến [6].

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước ít nhất là loại 1 của TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696:1987) hoặc nước cất hai lần, trừ khi có qui định khác.

4.2. Hóa chất và các dung dịch

4.2.1. Metanol, loại dùng cho HPLC, w(CH₃OH) ≥ 99,8 % (khối lượng).

4.2.2. Dung dịch axit acetic, c(CH₃COOH) = 0,02 mol/l.

4.2.3. Isobutanol, w(C₄H₁₀O) ≥ 98 %.

4.2.4. Natri dihydro phosphat, w(NaH₂PO₄) ≥ 99,8 %.

4.2.5. Axit clohydric, w(HCl) = 36 %.

4.2.6. Axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l.

4.2.7. Axit sulfuric, c(H₂SO₄) = 0,05 mol/l.

4.2.8. Natri hydroxit, w(NaOH) ≥ 99 %.

4.2.9. Dung dịch natri hydroxit, nồng độ khối lượng p(NaOH) = 150 g/l.

4.2.10. Dung dịch natri hydroxit, p(NaOH) = 200 g/l

4.2.11. Kali hexaxyanoferat III, w{K₃[Fe(CN)₆]} ≥ 99 %.

4.2.12. Dung dịch kali hexaxyanoferat III, p{K₃[Fe(CN)₆]} = 10 g/l.

4.2.13. Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất trước cột), p{K₃[Fe(CN)₆]} = 0,4 g/l.

Pha loãng 2,0 ml dung dịch hexaxyanoferat (4.2.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.2.9) đến 50 ml. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày phân tích.

4.2.14. Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất sau cột), p{K₃[Fe(CN)₆]} = 0,5 g/l.

Pha loãng 2,5 ml dung dịch hexaxyanoferat (4.2.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.2.10) đến 50 ml.

4.2.15. Enzym tách phospho, có khả năng thủy phân thiamin liên kết từ thực phẩm.

CHÚ THÍCH: Taka-Diataza1) đã được sử dụng để xác định các dữ liệu về độ chụm.

4.2.16. Dung dịch natri axetat, c(CH₃COONa.3H₂O) = 2,5 mol/l.

4.2.17. Dung dịch natri axetat, c(CH₃COONa.3H₂O) = 0,5 mol/l.

4.2.18. Pha động HPLC

Các ví dụ về các hỗn hợp thích hợp với các phần thể tích ví dụ như từ 10 % đến 50 % metanol (4.2.1) trong nước hoặc sử dụng phosphat hoặc dung dịch đệm axetat được nêu trong Phụ lục C. Khả năng sử dụng các tác nhân kết cặp ion cũng được nêu trong Phụ lục C.

4.2.19. Dung dịch đệm phosphat (pH = 3,5), c(KH₂PO₄) = 9,0 mmol/l.

4.2.20. Tetraetylamoniclorua, w(C₈H₂₀NCl) ≥ 98%.

4.2.21. Natri heptansulfonat, w(C₇H₁₅NaO₃S) ≥ 98%.

4.2.22. Dung dịch đệm axatat (pH = 4,0), c(CH₃COOH) = 50 mmol/l.

4.3. Chất chuẩn

4.3.1. Yêu cầu chung

Thiamin clorua hydroclorua có thể lấy được từ nhiều nhà cung cấp. Độ tinh khiết của các chất chuẩn thiamin có thể khác nhau, do đó có thể cần phải xác định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng đo phổ UV (xem 4.4.4).

4.3.2. Thiamin clorua hydroclorua, w(C₁₂H₁₇CIN₄OS.HCl) ≥ 99%.

4.3.3. Thiamin monophosphat clorua, w(C₁₂H₁₇CIN₄O₄PS) ≥ 98%.

4.3.4. Thiamin pyrophosphat clorua (cocarboxylaza), w(C₁₂H₁₉CIN₄O₇P₂S) ≥ 98%.

4.4. Dung dịch gốc

4.4.1. Thiamin clorua hydroclorua, p(C₁₂H₁₇CIN₄OS.HCl) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác của chất chuẩn thiamin clorua hydroclorua (4.3.2) trong một thể tích xác định của dung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn vitamin B₁ trong 100 ml axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được bốn tuần ở nhiệt độ +4^oC.

4.4.2. Thiamin monophosphat, p(C₁₂H₁₇CIN₄O₄PS) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác của chất chuẩn monophosphat (4.3.3) trong một thể tích xác định của dung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn monophosphat trong 100 ml axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được bốn tuần ở nhiệt độ - 20 ^oC.

4.4.3. Thiamin pyrophosphat p(C₁₂H₁₉CIN₄O₇P₂S) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác của chất chuẩn pyrophosphat (4.3.4) trong một thể tích xác định của dung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn pyrophosphat trong 100 ml axit clohydric (4.2.6).

4.4.4. Kiểm tra nồng độ

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) bằng dung dịch axit clohydric (4.2.6) trong bình định mức 100 ml đến vạch. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 247 nm trong cuvet 1 cm dựa vào dung dịch axit clohydric (4.2.6) trong cuvet đối chứng sử dụng máy đo phổ UV (5.2). Tính nồng độ khối lượng, p, bằng microgram trên mililit dung dịch gốc, sử dụng công thức (1):

P =  (1)

trong đó

 là giá trị hấp thụ của dung dịch ở bước sóng cực đại khoảng 247 nm;

421 là hệ số hấp thụ  của thiamin clorua hydroclorua trong axit clohydric 0,1 mol/l (xem [7]);

10 là hệ số pha loãng.

4.5. Dung dịch chuẩn

4.5.1. Thiamin clorua hydroclorua, p(C₁₂H₁₇CIN₄OS.HCl) ≈ 0,1 đến 10

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ^oC, nơi tối.

4.5.2. Thiamin monophosphat, p(C₁₂H₁₇CIN₄O₄PS) ≈ 0,1đến 10

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch gốc monophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ^oC ở nơi tối.

4.5.3. Thiamin pyrophosphat. p(C₁₂H₁₉CIN₄O₇P₂S) ≈ 0,1đến 10

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch gốc pyrophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ^oC ở nơi tối.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.2. Máy đo phổ UV

Có thể đo các độ hấp thụ ở các bước sóng xác định.

5.3. Thiết bị hấp áp lực hoặc làm nóng

Dùng thiết bị áp lực cho mục đích tách chiết, ví dụ như kiểu nồi hấp áp lực, có bộ phận ghi nhiệt độ và áp suất, bộ phận đốt nóng bằng điện hoặc nồi cách thủy.

5.4. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có các bước sóng phát xạ và kích thích đã cài đặt, ví dụ như 420 nm và 366 nm, tương ứng (xem Phụ lục C) và hệ thống đánh giá như bộ tích phân.

5.5. Cột HPLC

5.5.1. Yêu cầu chung

Có thể sử dụng các cột hoặc cỡ hạt có kích cỡ khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số riêng cần phù hợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Chuẩn mực thực hiện đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải đường nền của các chất phân tích có liên quan2).

5.5.2. Ôxy hóa trước cột

Cột phân tích, ví dụ như Lichropher^® 60 RP Select B ²⁾, cỡ hạt 5 , đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm.