Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 6187-2:2020 ISO 9308-2:2012 Chất lượng nước – Phương pháp định lượng vi khuẩn Escherichia coli và coliform – Phần 2: Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 6187-2:2020
ISO 9308-2:2012

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM -

PHẦN 2: KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT

Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria -
Part 2: Most probable number method

Lời nói đầu

TCVN 6187-2:2020 thay thế cho TCVN 6187-2:1996.

TCVN 6187-2:2020 hoàn toàn tương đương với ISO 9308-2:2012;

TCVN 6187-2:2020 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 6187 Chất lượng nước - Định lượng vi khuẩn Escherichia coli và coliform gồm các tiêu chuẩn sau:

- TCVN 6187-1:2019 (ISO 9308-1:2014) Phần 1: Phương pháp lọc màng áp dụng cho nước có số lượng vi khuẩn thấp.

- TCVN 6187-2:2020 (ISO 9308-2:2012) Phần 2: Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất.

Lời giới thiệu

Sự ô nhiễm và mức độ ô nhiễm phân là một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá chất lượng nước và nguy cơ lây nhiễm cho sức khỏe con người. Việc kiểm tra sự có mặt của E. coli trong nước được coi là chỉ thị về sự ô nhiễm phân vì E. coli thường cư trú trong đường ruột của người và các động vật máu nóng khác. Việc chỉ kiểm tra vi khuẩn coliform có thể khó giải thích hơn vì một số coliform sống ở đất và nước bề mặt mà không phải lúc nào cũng ở trong đường ruột. Do vậy, sự có mặt của vi khuẩn coliform tuy không phải là bằng chứng của sự nhiễm phân nhưng có thể chỉ ra việc xử lý không đúng cách hoặc vấn đề của đường nước vào hệ thống phân phối.

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM -
PHẦN 2: KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT

Water quality - Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria -
Part 2: Most probable number method

CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này phải là người có kỹ năng phân tích trong phòng thử nghiệm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đếm vi khuẩn E. coli và coliform trong nước. Phương pháp này dựa trên kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật đích trong môi trường lỏng và tính toán “Số xác xuất lớn nhất” (Most Probable Number- MPN) của vi sinh vật theo bảng chỉ số MPN. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các loại nước, bao gồm nước chứa một lượng đáng kể chất lơ lửng và số lượng lớn vi khuẩn dị dưỡng. Tuy nhiên tiêu chuẩn này không nên áp dụng để đếm vi khuẩn coliform trong nước biển. Khi áp dụng để đếm E. coli trong nước biển, phải tiến hành pha loãng với nước vô trùng theo tỷ lệ 1→10, mặc dù phương pháp cho thấy áp dụng được với một số loại nước biển có nồng độ muối thấp hơn bình thường. Trong trường hợp không có dữ liệu để hỗ trợ phương pháp không pha loãng thì cần pha loãng 1→10.

Phương pháp phát hiện E. coli dựa vào sự có mặt của enzyme β-D-glucoronidaza, do đó không phát hiện được nhiều chủng E. coli gây xuất huyết ruột vì các chủng đó không biểu hiện điển hình enzyme này. Ngoài ra một số lượng nhỏ chủng E. coli khác cũng không sinh enzyme β-D-glucoronidaza.

Sự lựa chọn các phép thử trong phát hiện và khẳng định nhóm vi khuẩn colitorm, bao gồm E. coli có thể được xem như 1 bước tiếp theo của qui trình. Phạm vi khẳng định với một mẫu cụ thể phụ thuộc bản chất của nước và lý do của việc kiểm tra. Thử nghiệm được mô tả trong tiêu chuẩn này cho kết quả đã được khẳng định mà không yêu cầu xác nhận thêm các giếng dương tính.

CHÚ THÍCH: Phương pháp này đưa ra việc sử dụng dụng cụ đếm thương mại sẵn có, nhưng môi trường được mô tả ở đây cũng có thể được sử dụng cho dạng MPN tiêu chuẩn.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6450 (ISO/IEC Guide 2:2004), Tiêu chuẩn hóa và các hoạt động có liên quan - Thuật ngữ chung và định nghĩa.

TCVN 8880 (ISO 19458), Chất lượng nước - Lấy mẫu để phân tích vi sinh vật.

TCVN 9716 (ISO 8199), Chất lượng nước - Hướng dẫn chung về đếm vi sinh vật bằng nuôi cấy.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1

Vi khuẩn coliform (coliform bacterium)

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae sinh enzyme β-D-galactosidaza.

3.2

Vi khuẩn Escherichia coli (Escherichia coli)

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae sinh enzyme β-D- galactosidaza và enzyme β-D-glucoronidaza

4  Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên việc tiến hành cho 1 túi môi trường khô vào 100 ml mẫu nước hoặc pha loãng mẫu đến 100 ml. Lắc nhẹ để trộn đều và hòa tan môi trường và rót vô trùng vào trong khay định lượng Quanti-Tray¹⁾ hoặc Quanti-Tray 2000¹⁾ để đếm được từ 201 đến 2419 vi sinh vật trong 100 ml tương ứng. Các giếng trên khay được bao kín bằng máy bao gói (Quanti-Tray Sealer¹⁾) và sau đó được ủ ở (36 ± 2) °C từ 18 h đến 24 h.

Sau khi ủ, các giếng xuất hiện màu vàng tương đương hoặc đậm hơn màu của các giếng chứng dương được coi là vi khuẩn coliform. Các giếng màu vàng có phát huỳnh quang dù ít hay nhiều đều được coi là dương tính với vi khuẩn E. coli.

Số xác xuất lớn nhất (MPN) của vi khuẩn colitorm và E. coli trong 100 ml mẫu có thể được xác định bằng giá trị trung bình trong bảng thống kê hoặc chương trình máy tính đơn giản.

CHÚ THÍCH Việc chuyển màu vàng có thể nhìn thấy được bằng mắt thường là kết quả từ quá trình phân hủy ortho-nitrophenol galactoside bởi enzym β-D-galactosidaza. Sự phát huỳnh quang được quan sát dưới tia cực tím ở bước sóng 365 nm là do sự phân hủy phân tử 4-methylumbelliferyl glucuronide (MUG) bởi enzyme β-D-glucoronidaza để tạo thành hợp chất huỳnh quang methyl umbelliferone.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể như sau:

5.1  Thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực), Thiết bị và dụng cụ thủy tinh chưa vô trùng nên được khử trùng theo hướng dẫn đưa ra trong TCVN 9716:2013 (ISO 8199).

5.2  Tủ sấy, để khử trùng khô.

5.3  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ (36 ± 2) °C.

5.4  Máy bao gói, Quanti-Tray²⁾.

5.5  Bình miệng rộng vô trùng, có dung tích chứa ít nhất là 110 ml.

5.6  Máy so mẫu Quanti-Tray.

5.7  Đèn cực tím, 365nm.

5.8  Khay định lượng Quanti-Tray²⁾ hoặc Quanti-Tray/2000²⁾, xem phụ lục B.

6  Môi trường nuôi cấy và hóa chất

6.1  Các nguyên liệu cơ bản

Phương pháp này sử dụng Colilert-18³⁾, là môi trường khô đóng gói sẵn được sử dụng cho 100 ml mẫu. Mỗi gói chứa 2,8 g môi trường đủ cho một thử nghiệm đơn lẻ. Môi trường được bảo quản ở điều kiện 2 °C đến 25 °C, tránh ánh nắng trực tiếp và nên được sử dụng trước hạn sử dụng ghi trên gói.

Môi trường này gồm 2 phần hợp thành môi trường hoàn chỉnh được trình bày trong Phụ lục C.

6.2  Dung dịch pha loãng

Chỉ sử dụng nước vô trùng không có chất ức chế hoặc nước không có chất oxy hóa (nước loại ion) để pha loãng môi trường Colilert-18³⁾. Việc sử dụng dung dịch đệm, dịch pha loãng chứa muối hoặc peptone sẽ ảnh hưởng đến hiệu năng của thử nghiệm.

6.3  Chất chống tạo bọt (Antifoam B)

Chất chống tạo bọt 10 % hoạt tính, nhũ tương của silicon.

7  Lấy mẫu

Lấy mẫu và đưa đến phòng thử nghiệm theo TCVN 8880 (ISO 19458)

8  Cách tiến hành

8.1  Chuẩn bị mẫu

Phải vận chuyển và bảo quản mẫu ở (5 ± 3) °C theo TCVN 8880 (ISO 19458) và phân tích trong ngày hoặc trong vòng 18 h. Trong trường hợp đặc biệt, các mẫu có thể được giữ ở (5 ± 3) °C trong 24 h trước khi kiểm tra.

8.2  Nuôi cấy

Cho một cách vô trùng gói môi trường Colilert-18³⁾ (2,8 g) vào một bình có chứa 100 ml mẫu ban đầu hoặc 100 ml mẫu đã pha loãng. Khi môi trường tan hoàn toàn, chuyển vô trùng vào khay định lượng Quantri-Tray hoặc Quanti-Tray/2000 và hàn kín bằng máy bao gói. Mẫu nước biển nên được pha loãng theo tỷ lệ 1 → 10 lần với nước vô trùng. Để giảm thiểu bọt khí trong giếng, mẫu có thể được xử lý trong bình vô trùng có chứa chất chống tạo bọt hoặc sử dụng lọ có ống hút nhỏ giọt để cho chất chống tạo bọt vào từng bình. Việc sử dụng một trong hai cách chống tạo bọt là tùy chọn của phòng thử nghiệm. Ngoài ra, mẫu nước có chứa môi trường Colilert-18³⁾ đã được làm tan có thể được phân phối vào các ống vô trùng để xác định MPN theo phương pháp MPN truyền thống. (ví dụ: 1 x 50 ml và 5 x 10 ml). Nếu nuôi cấy một thể tích 100 ml thì phương pháp có thể được coi như một phép thử phát hiện có hoặc không có mặt vi khuẩn coliform và E. coli. Khi áp dụng một trong hai cách MPN này thì các ống phải được làm ấm tới (36 + 2) °C trong 20 phút trước khi bắt đầu nuôi cấy.

Khi khuyến cáo rằng các mẫu nước biển phải pha loãng 1 ->10 bằng nước loại ion trước khi tiến hành phân tích thi cần lưu ý: Tại một số khu vực địa lý có nồng độ muối trong nước biển đủ thấp cho phép nuôi cấy mà không cần pha loãng. Nếu áp dụng qui trình này thì phải có sẵn dữ liệu về nồng độ muối có hiệu lực. Nếu độ mặn của nước biển biến đổi đáng kể thì phòng thử nghiệm cần phải xác định việc pha loãng.

8.3  Ủ

Ủ khay định lượng Quanti-Tray đã được cấy mẫu từ 18 h đến 24 h ở (36 ± 2) °C.

8.4  Kiểm tra kết quả

Kiểm tra khay định lượng Quanti-Tray hoặc Quanti-Tray/2000 sau khi ủ từ 18 h đến 24 h và những giếng xuất hiện màu vàng tương đương hoặc đậm hơn màu chuẩn của máy Quanti-Tray được coi là vi khuẩn coliform dương tính. Kiểm tra các khay dưới ánh sáng UV (365 nm) trong phòng tối hoặc trong buồng tối. Bất kỳ một giếng màu vàng nào có phát huỳnh quang dù ít hay nhiều đều được coi là dương tính với vi khuẩn E. coli. Nếu kết quả không rõ rệt sau 18 h (ví dụ, màu vàng nhạt hơn màu chuẩn của máy) thì nên kéo dài thời gian ủ đến 22 h. Kết quả dương tính với vi khuẩn coliform và E. coli quan sát được trước 18 h ủ cũng như kết quả âm tính quan sát được sau 22 h cũng là hợp lý.

9  Biểu thị kết quả

Từ số giếng dương tính trên khay định lượng Quanti-Tray hoặc Quanti-Tray/2000, giá trị MPN/100 ml cho cả vi khuẩn coliform và E. coli có thể được tính bằng cách tham khảo các bảng thống kê hoặc bằng cách sử dụng chương trình cho MPN trong máy tính, xem bảng B1, bảng B2.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) Phương pháp thử nghiệm được sử dụng (viện dẫn tiêu chuẩn này);

b) Mọi chi tiết để nhận dạng đầy đủ mẫu;

c) Kết quả thể hiện phù hợp với Điều 9;

d) Những sự cố đặc biệt quan sát được trong suốt quá trình phân tích và mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

11  Đảm bảo chất lượng

Các phòng thử nghiệm phải có một hệ thống kiểm soát chất lượng được xác định rõ ràng để đảm bảo rằng các thiết bị, hóa chất, và các kỹ thuật phù hợp cho việc kiểm tra. Việc sử dụng các chứng dương, chứng âm, mẫu trắng là một phần của thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin bổ sung về vi khuẩn coliform

Ngoài sinh enzyme β-D-galactosidaza, coliform là vi khuẩn hình que, gram âm điển hình, không tạo bào tử, oxidaza âm, có khả năng phát triển hiếu khí và kị khí khi có mặt của muối mật (hoặc các chất hoạt động bề mặt khác có đặc tính ức chế phát triển tương tự), có khả năng lên men lactose sinh axit và aldehyt trong 48 h sau khi ủ ở (36 ± 2) °C. Ngoài sinh enzyme β-D-glucuronidaza, E. coli là vi khuẩn coliform có khả năng sinh indol từ tryptophan trong vòng (21 ± 3) h ở (44 ± 0,5) °C, có phản ứng đỏ methyl dương tính và có thể khử nhóm carboxyl của axit L-glutamic nhưng không tạo thành acetyl methyl carbinol, sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất hoặc phát triển trong canh thang KCN.

Một số chủng E. coli âm tính β-D-glucuronidaza, như E. coli 0157, sẽ không được phát hiện là E. coli nhưng được coi như là vi khuẩn coliform vì chúng dương tính với enzyme β-D-galactosidaza.

Phụ lục B

(Quy định)

Máy bao gói Quanti-Tray và cách tính kết quả

B.1  Yêu cầu chung

Quanti-Tray Sealer là một thiết bị bao gói bằng nhiệt tạo nên một lớp ngăn cách giữa các giếng của khay định lượng Quanti-Tray. Máy bao gói tự động phân phối chất lỏng chứa mẫu và môi trường vào các giếng của khay định lượng Quanti-Tray hoặc Quanti-Tray/2000. Khay định lượng Quanti-Tray được sử dụng khi đếm 1 số lượng vi khuẩn nhỏ hơn 200 CFU/100 ml. Khay định lượng Quanti-Tray/2000 có thể được sử dụng để ước tính số xác suất lớn nhất lên tới 2419 CFU/100 ml. Khi ước tính số xác suất lớn nhất, các bảng được cung cấp theo khay định lượng là tài liệu tham khảo cho tính kết quả. Một chương trình thống kê đơn giản cũng có thể được sử dụng để tính toán kết quả. Nếu có thể, số có xác suất lớn nhất có thẻ được tính theo phương pháp được đưa ra dưới đây.

B.2  Cách tính số có xác suất lớn nhất (MPN)

B.2.1  Cách tính số có xác suất lớn nhất cho khay định lượng Quanti-Tray và Quanti-Tray/2000

B.2.1.1  Khay định lượng Quanti-Tray (51 giếng)

Mỗi giếng chứa mẫu có thể tích xấp xỉ 1,96 ml.

Các giếng tràn chứa một lượng tối thiểu là 8,5 ml.

Cách tính kết quả từ khay định lượng Quanti-Tray MPN (bảng B.1), xem Công thức (B.1)

N_MPN= N. In [N/(N-X)] (B.1)

Trong đó:

N_MPN là số có xác suất lớn nhất;

N là tổng số giếng (ống) đã được sử dụng trong thử nghiệm;

X là tổng số giếng (ống) dương tính đã quan sát được trong thử nghiệm.

B.2.1.2  Khay định lượng Quanti-Tray/2000 (97 giếng)

Mỗi giếng nhỏ có thể tích trung bình là 0,186 ml.

Các giếng lớn có thể tích trung bình là 1,86 ml.

Các giếng tràn chứa một lượng xấp xỉ 11 ml.

Cách tính kết quả từ khay định lượng Quanti-Tray/2000 MPN (bảng B.2), xem Công thức (B.2)

Trong đó:

d_i là hệ số pha loãng ở mức pha loãng i (ví dụ 0,1 đối với pha loãng tỷ lệ 1:10);

K là số mức pha loãng;

n_i là số giếng (ống) ở mức pha loãng i;

N_mpn là số có xác suất lớn nhất;

P_i là số giếng dương tính ở mức pha loãng i;

V_i là thể tích của giếng ở mức pha loãng i.

Khoảng tin cậy 95 % có thể căn cứ vào:

T₀ = (In N_mpn - 1,96) x ε(ln N_mpn)

T₁ = (In N_mpn + 1,96) x ε(ln N_mpn)

Trong đó

T₀ là giới hạn dưới;

T₁ là giới hạn trên;

ε là độ lệch chuẩn; và

Bảng B.1 - Khay định lượng Quanti-Tray MPN 51 giếng

Bảng B.2 - Khay định lượng Quanti-Tray MPN 97 giếng với độ tin cậy 95 %