Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 13451:2021 ISO 11731:2017 Chất lượng nước - Định lượng Legionella

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13451:2021

ISO 11731:2017

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - ĐỊNH LƯỢNG LEGIONELLA

Water quality- Enumeration of Legionella

Lời nói đầu

TCVN 13451:2021 hoàn toàn tương đương với ISO 11731:2017;

TCVN 13451:2021 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Sau đợt bùng phát bệnh viêm phổi cấp do Legionnaire đầu tiên được phát hiện vào năm 1976 vi khuẩn đã được phân lập được đặt tên là Legionella pneumophila. Họ Legionellae được tìm thấy rộng rãi trong môi trường nước tự nhiên và nhân tạo, đất, phân ủ và có thể gây ra bệnh viêm phổi cấp. Họ Legionellae có thể phát triển trong tế bào trong các động vật nguyên sinh như Acanthamoeba castellanii, Hartmannella hoặc Naegleria. Có ít nhất 61 loài Legionella khác nhau đã được mô tả. Trong đó có 26 loài, một số chủng lây nhiễm sang người đã được ghi nhận. Legionella pneumophila có thể được phân loại thành ít nhất 15 nhóm huyết thanh khác nhau; chín loài khác cũng có thể được phân loại thành ít nhất hai nhóm huyết thanh riêng biệt. Việc theo dõi họ legionellae rất quan trọng vì lý do sức khỏe cộng đồng để xác định các nguồn môi trường có thể gây ra nguy cơ nhiễm legionella, như các tháp làm mát bay hơi, các hệ thống phân phối nước nóng và nước lạnh trong các tòa nhà và các thiết bị liên quan như các bồn spa, phòng nha khoa, các máy điều hòa không khí, v.v ... Việc theo dõi này cũng rất quan trọng để đánh giá hiệu lực của các biện pháp kiểm soát và xác minh về tính hiệu lực liên tục về các biện pháp kiểm soát.

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - ĐỊNH LƯỢNG LEGIONELLA

Water quality- Enumeration of Legionella

CẢNH BÁO Người dùng tiêu chuẩn này cần phải thành thạo với thực hành trong phòng thí nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn này không đề cập đến mọi vấn đề an toàn liên quan đến người sử dụng. Trách nhiệm của người sử dụng là phải xác lập độ an toàn, đảm bảo sức khỏe và phù hợp với các quy định liên quan.

QUAN TRỌNG  Điều quan trọng là phép thử tiến hành theo tiêu chuẩn này cần được thực hiện bởi những nhân viên được đào tạo phù hợp.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định các phương pháp phân lập và định lượng Legionella trong mẫu nước.

Các phương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các loại mẫu nước bao gồm nước ăn uống, nước công nghiệp, nước thải và nước tự nhiên. Các phương pháp này có thể được sử dụng cho các nền mẫu liên quan đến nước, ví dụ: màng sinh học, trầm tích, v.v...

Không phải tất cả các loài Legionella đều có thể nuôi cấy được; do đó, các phương pháp đề cập trong tiêu chuẩn này không thu hồi được tất cả các loài Legionella.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thử nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

TCVN 8880 (ISO 19458) Chất lượng nước - Lấy mẫu để phân tích vi sinh vật

TCVN 9716 (ISO 8199) Chất lượng nước - Hướng dẫn chung để đếm vi sinh vật bằng nuôi cấy

ISO 7704 Water quality - Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses (Chất lượng nước - Đánh giá màng lọc sử dụng cho phép phân tích vi sinh)

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1

Legionella (Legionella)

chi của các vi sinh vật thường cỏ khả năng phát triển trên thạch chứa chất chiết nấm men đệm than (BCYE) có chứa L-cysteine và muối sắt (III)

CHÚ THÍCH 1: Thông tin về các loài Legionella, xem Phụ lục A.

4  Nguyên tắc

4.1  Yêu cầu chung

Legionellae trong mẫu nước được cô đặc bằng cách lọc màng, được pha loãng hoặc được cấy đĩa trực tiếp tùy thuộc vào nguồn gốc/đặc tính của mẫu. Mức phát hiện mong muốn có thể thay đổi tùy thuộc vào yêu cầu về pháp luật và lý do lấy mẫu hoặc điều tra. Các mẫu dự đoán chứa nhiều legionellae, ví dụ như các mẫu thu được trong quá trình điều tra ổ dịch, có thể được xử lý có và/hoặc không có các bước cô đặc. Để giảm bớt sự phát triển của các vi khuẩn không phải đích bị cô đặc, có thể cản trở sự thu hồi legionellae đích, các phần mẫu nước được xử lý nhiệt, xử lý axit hoặc kết hợp cả hai biện pháp xử lý.

Cần pha loãng khi dự đoán có mặt Legionella và các vi khuẩn khác với nồng độ cao. Các phần riêng biệt của mẫu đã pha loãng phải được xử lý trước; một phần được xử lý nhiệt và một phần được xử lý bằng dung dịch axit, hoặc trong trường hợp các mẫu bị nhiễm quá cao, thì cần sự kết hợp của dung dịch axit và đun nóng trước khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc.

Các phần mẫu đã xử lý và/hoặc chưa xử lý được chuyển vào các đĩa môi trường nuôi cấy chọn lọc cho phân tích Legionella và được ủ.

CHÚ THÍCH: Xử lý cơ học đối với mẫu có thể làm tăng khả năng thu hồi Legionella.

4.2  Kiểm tra

Sau khi ủ, các khuẩn lạc đặc trưng về hình thái trên môi trường nuôi cấy chọn lọc được coi là Legionella giả định.

4.3  Khẳng định

Các khuẩn lạc giả định được khẳng định là Legionella bằng cấy truyền khi chứng minh được yêu cầu phát triển của chủng đối với L-cysteine và sắt (III).

CHÚ THÍCH: Nếu yêu cầu xác định loài và kiểu huyết thanh thì cần có các thử nghiệm tiếp theo (xem Phụ lục G). Các thử nghiệm này không phải là một phần của các phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này.

5  Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị sau:

5.1  Đĩa Petri vô trùng

5.2  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở (36 ± 2) °C.

5.3  Đèn tia cực tím, phát ánh sáng ở bước sóng (360 ± 20) nm.

5.4  Dụng cụ lọc màng, thích hợp để lọc các lượng 10 mL đến 1 000 mL.

5.4  Bộ lọc màng

5.5.1  Bộ lọc màng để cô đặc và rửa giải, màng lọc polycarbonate hoặc polyethersulfone, đường kính 47 mm đến 742 mm với kích thước lỗ danh định là 0,2 µm; xem Tài liệu tham khảo [6]. Các loại màng lọc này được sử dụng cho quy trình cô đặc, sau đó là quy trình rửa.

5.5.2  Bộ lọc màng để đặt trực tiếp trên môi trường nuôi cấy, màng lọc hỗn hợp từ xenlulo nitrat hoặc este xenlulo hỗn hợp, đường kính 47 mm đến 50 mm với kích thước lỗ danh định là 0,2 µm hoặc 0,45 µm. Các loại màng lọc này được sử dụng để đặt trực tiếp lên môi trường nuôi cấy sau khi lọc. Các bộ lọc phải được đánh giá theo ISO 7704 trước khi sử dụng.

CHÚ THÍCH: Bộ lọc màng tối màu tương phản tốt hơn với các khuẩn lạc Legionella màu trắng so với bộ lọc màng sáng màu.

5.6  Máy đo pH, với độ chính xác đến ± 0,1 ở nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C.

5.7  Máy trộn Vortex.

5.8  Bể cách thủy có siêu âm, phù hợp để đảm bảo rằng mức chất pha loãng phủ trên màng lọc nằm dưới mực nước trong bể cách thủy

5.9  Bể cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở (50 ± 1) °C

5.10  Dụng cụ thủy tinh, được tiệt trùng theo ISO 8199.

5.11  Kính hiển vi soi nổi, có độ phóng đại ít nhất là 4x và có chiếu sáng xiên.

CHÚ THÍCH: Ngoài ra, có thể sử dụng ống kính cầm tay (độ phóng đại ít nhất là 4x).

5.12  Kẹp đã khử trùng, để xử lý các bộ lọc màng.

CHÚ THÍCH: Kẹp có đầu tròn thường được sử dụng để không làm hỏng màng trong quá trình xử lý.

5.13  Vật chứa vô trùng có nắp vặn, có hoặc không kèm theo các viên bi thủy tinh vô trùng. Để đảm bảo lấy tối đa legionellae ra khỏi màng lọc, có thể cho thêm các viên bi thủy tinh vô trùng (đường kính từ 2 mm đến 3 mm) vào vật chứa vô trùng. Cho lượng bi thủy tinh vừa đủ vào hộp chứa vô trùng vừa đủ để phủ kín đáy vật chứa.

6  Thuốc thử và môi trường nuôi cấy

Sử dụng hóa chất loại phân tích để chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử trừ khi có quy định khác (xem Chú thích). Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử theo hướng dẫn nêu trong Phụ lục B, C và D, Chuẩn bị môi trường nuôi cấy sử dụng nước cất hoặc nước đã loại khoáng, không chứa các chất có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật trong các điều kiện thử nghiệm. Nước phải phù hợp với các yêu cầu của loại 3 trong TCVN 4851 (ISO 3696).

Ngoài ra, có thể sử dụng các thuốc thử và môi trường nuôi cấy bán sẵn được chuẩn bị và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các hóa chất có độ tinh khiết khác, nếu được chứng minh là có hiệu năng như nhau trong phép thử.

6.1  Môi trường nuôi cấy

Xem Phụ lục B.

6.1.1  Thạch chất chiết nấm men than (BCYE)

Xem B.1.

6.1.2  Thạch chất chiết nấm men than không có L-cysteine (BCyE-cys).

Xem B.2.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thạch máu (xem B.6), thạch dinh dưỡng (xem B.7) hoặc thạch đậu tương tryptone (xem B.8) thay cho thạch BCYE-cys.

6.1.3  Thạch chất chiết nấm men than có các chất bổ sung chọn lọc (BCYE + AB).

Xem B.3.

6.1.4  Thạch glycine vancomycin polymyxin B cycloheximide (GVPC).

Xem B.4.

6.1.5  Thạch Wadowsky Yee (MWY) cải biến.

Xem B.5.

6.2  Chất pha loãng.

Xem Phụ lục C.

6.2.1  Nước muối Page.

Xem C.1.

6.2.2  Dung dịch Ringer pha loãng.

Xem C.2.

6.3  Dung dịch axit

Xem Phụ lục D.

7  Lấy mẫu

Tiến hành lấy mẫu, vận chuyển và bảo quản mẫu theo TCVN 8880 (ISO 19458). Cẩn thận không để mẫu tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ bất lợi (ví dụ: đóng băng hoặc quá nóng).

CHÚ THÍCH  Sử dụng các vật chứa cách nhiệt để mẫu không tiếp xúc với điều kiện nhiệt độ bất lợi.

8  Cách tiến hành

8.1  Mẫu thử

Do tính chất phức tạp của các nền mẫu khác nhau, phòng thử nghiệm phải xác định phương pháp thích hợp cho từng loại mẫu. Quyết định nền mẫu được cung cấp trong Phụ lục J để xác định phương pháp thích hợp nào sẽ được thực hiện. Phụ lục J mô tả các yêu cầu và cung cấp các tùy chọn bổ sung.

Để đảm bảo phát hiện legionellae từ các mẫu nước, trong hầu hết các trường hợp cần phải có kỹ thuật cô đặc bằng cách sử dụng bộ lọc màng (xem 8.2.2 hoặc 8.2.3). Trong trường hợp nồng độ legionellae dự kiến lớn hơn 10⁴ đơn vị hình thành khuẩn lạc trên lít (cfu/L), cũng có thể tiến hành cấy đĩa trực tiếp mẫu chưa cô đặc. Đối với các mẫu bị nhiễm cao, cần pha loãng (tham khảo Phụ lục C để biết chất pha loãng thích hợp) và sử dụng phương pháp cấy đĩa trực tiếp trước và sau khi xử lý sơ bộ (xem 8.3). Ghi lại thể tích của mẫu đã được pha loãng hoặc xử lý và biện pháp xử lý sơ bộ đã sử dụng.

Khi không xác định được số lượng legionellae trong một mẫu bất kỳ, thì thường áp dụng các kỹ thuật cô đặc. Khi đó, thực hiện theo quy trình được mô tả trong 8.2.2 hoặc 8.2.3.

8.2  Nồng độ của mẫu nước

8.2.1  Yêu cầu chung

Mô tả chung về kỹ thuật lọc màng, xem ISO 8199. Việc lọc có thể được thực hiện bằng lọc chân không hoặc lọc áp suất dương.

Tốc độ dòng chảy phải được điều chỉnh để không vượt quá mức tối đa do nhà sản xuất quy định cho kích thước hoặc loại bộ lọc.

CHÚ THÍCH: Quy trình đối với các nền mẫu mẫu liên quan đến nước (tăm bông, trầm tích v.v...) được mô tả trong Phụ lục I.

8.2.2  Lọc màng và đặt trực tiếp màng lọc lên môi trường nuôi cấy

Lọc mẫu nước (không qua xử lý, sau khi xử lý bằng axit và, nếu cần, sau khi xử lý nhiệt) qua màng lọc xenlulozo nitrat hoặc màng lọc este xenluloza hỗn hợp (5.5.2). Việc xử lý bằng axit cũng có thể được thực hiện trực tiếp trên màng lọc trong phễu (xem 8.3.2). Thể tích cần lọc phụ thuộc vào hàm lượng hạt trong nước hoặc mức phát hiện mong muốn. Thể tích mẫu đã lọc phải được ghi lại. Cẩn thận tháo màng lọc ra khỏi giá đỡ bằng kẹp đã khử trùng (5.1.2) và đặt (hướng lên trên) trực tiếp trên môi trường nuôi cấy, đảm bảo rằng không bị lẫn bọt khí.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp không thể cô đặc bằng cách lọc (ví dụ, do lượng cặn cao), mẫu có thể được cô đặc bằng cách ly tâm (xem Phụ lục F).

8.2.3  Quy trình lọc màng kết hợp với rửa giải

Lọc mẫu nước qua màng lọc polycarbonate hoặc polyethersulfone (5.5.1). Thể tích được lọc phụ thuộc vào hàm lượng hạt trong nước hoặc mức độ phát hiện được yêu cầu. Phải ghi lại thể tích đã lọc của mẫu. Tháo bộ lọc màng ra khỏi giá đỡ bằng kẹp đã khử trùng (5.12). Thực hiện cẩn thận để tránh thất thoát phần đọng lại. Đặt màng lọc (úp xuống) trong hộp đựng vô trùng nắp vặn có hoặc không có viên bi thủy tinh vô trùng (5.13). Để rửa vi sinh vật ra khỏi màng lọc, thêm từ 5 mL đến 10 mL dung dịch pha loãng vô trùng (xem Phụ lục C) hoặc mẫu và lắc mạnh trên máy trộn Vortex (5.7) ít nhất 2 min. Cách khác, đặt vật chứa (5.13) trong bể cách thủy có siêu âm (5.8) trong một khoảng thời gian đã được xác nhận là khoảng thời gian tối ưu để đạt được độ thu hồi tối đa. Đảm bảo rằng mức của chất pha loãng phủ trên màng nằm thấp hơn mức nước trong bể cách thủy có siêu âm.

Phần cô đặc này đại diện cho mẫu đã chuẩn bị. Ghi lại thể tích của phần cô đặc. Màng lọc có thể được cắt thành nhiều mảnh bằng kéo vô trùng để hỗ trợ cho việc rửa giải.

Chia phần cô đặc thu được thành ba phần. Sử dụng một phần chưa xử lý, một phần để xử lý bằng nhiệt (xem 8.3.1) và một phần để xử lý bằng dung dịch axit (xem 8.3.2).

CHÚ THÍCH 1: Ngoài ra, có thể sử dụng kỹ thuật cạo hoặc vét để lấy vi khuẩn ra khỏi màng lọc (xem Phụ lục E).

CHÚ THÍCH 2: Trường hợp không thực hiện cô đặc bằng lọc (ví dụ: do có nhiều cặn lắng), thì có thể cô đặc bằng cách ly tâm (xem Phụ lục F).

CHÚ THÍCH 3: Có thể sử dụng bộ lọc màng bổ sung để xử lý sơ bộ axit trực tiếp trên bộ lọc màng trong phễu.

8.3  Xử lý sơ bộ mẫu

8.3.1  Xử lý nhiệt

Cho mẫu (cô đặc hoặc không cô đặc) vào vật chứa vô trùng và đặt trong bể cách thủy (5.9) ở (50 ± 1) °C trong (30 ± 2) min. Nên sử dụng các lượng thể tích nhỏ (≤ 5 mL) để đảm bảo khoảng thời gian ngắn cho đến khi đạt được nhiệt độ mong muốn. Nếu nhiều mẫu được xử lý cùng nhau hoặc các lượng thể tích lớn được xử lý hoặc sử dụng vật chứa có thành dày, thì cần theo dõi nhiệt độ trong vật chứa riêng rẽ tương tự như được sử dụng đối với mẫu. Thời gian bắt đầu tính khi đạt được nhiệt độ yêu cầu. Cần làm mát các lượng mẫu lớn hoặc các vật chứa có thành dày để tránh quá nhiệt sau khi lấy ra khỏi bể cách thủy.

8.3.2  Xử lý bằng axit

Pha loãng một thể tích mẫu (cô đặc hoặc không đậm đặc) với chín thể tích dung dịch axit (xem Phụ lục D), trộn đều và để trong (5,0 ± 0,5) min. Nếu sử dụng mẫu đã xử lý bằng axit được pha loãng để tính nồng độ cuối cùng của các loài Legionella trong mẫu, thì cần đưa hệ số pha loãng vào phép tính kết quả. Có thể đổ đĩa các thể tích lớn hơn 0,1 mL để giảm giới hạn phát hiện.

Xử lý bằng axit cũng có thể được thực hiện trực tiếp trên màng lọc trong phễu. Chuyển khoảng 30 mL dung dịch axit (xem Phụ lục D) vào màng lọc. Để trong (5 ± 0,5) min và loại bỏ dung dịch axit bằng cách lọc. Rửa màng lọc bằng ít nhất bằng 20 mL dung dịch chất pha loãng (xem Phụ lục C). Điều quan trọng là chất pha loãng không tráng rửa bề mặt phễu chưa tiếp xúc với dung dịch axit.

8.4  Nuôi cấy

8.4.1  Yêu cầu chung

Việc lựa chọn phương pháp định lượng các loài Legionella phụ thuộc vào nguồn gốc/đặc tính của mẫu và lý do của việc lấy mẫu hoặc điều tra. Phải đưa ra giả định về nồng độ dự kiến của vi sinh vật tạp dựa trên kinh nghiệm hoặc nguồn gốc của mẫu. Ngoài ra, giới hạn dưới mong muốn của mức phát hiện cũng cần được xem xét. Nền mẫu quyết định việc chọn phương pháp thích hợp được mô tả chi tiết trong Phụ lục J.

Tùy thuộc vào mức phát hiện mong muốn, có thể sử dụng nhiều hơn một đĩa môi trường nuôi cấy khác nhau được đề cập trong các điều dưới đây.

8.4.2  Mẫu có nồng độ cao các loài Legionella và nồng độ vi sinh vật tạp thấp

Cấy trực tiếp ra đĩa nếu số lượng Legionella dự kiến vượt quá 10⁴ cfu/L. Cấy và dàn 0,1 mL đến 0,5 mL mẫu lên một đĩa thạch BCYE (xem B.1) và một đĩa thạch BCYE + AB (xem B.3). Ghi lại thể tích đã cấy.

8.4.3  Mẫu có nồng độ thấp của các loài Legionella và nồng độ vi sinh vật tạp thấp

8.4.3.1  Đặt trực tiếp màng lọc lên môi trường nuôi cấy sau khi lọc màng

Lọc mẫu (xem 8.2.2) và đặt màng lọc chưa xử lý trực tiếp lên một đĩa thạch BCYE (xem B.1). Các màng lọc được xử lý bằng dung dịch axit theo 8.3.2 được đặt trên một hoặc nhiều đĩa chọn lọc hoặc chọn lọc cao của thạch BCYE+AB (xem B.3) hoặc thạch GVPC (xem B.4) hoặc thạch MWY (xem B.5).

8.4.3.2  Cấy đĩa sau khi lọc màng với quy trình rửa

Cấy và dàn đều 0,1 mL đến 0,5 mL từng phần mẫu đã cô đặc (chưa xử lý, đã xử lý nhiệt và xử lý axit) từ màng quy trình lọc có rửa (xem 8.2.3) trên một đĩa thạch BCYE (xem B.1) và trên một hoặc nhiều đĩa chọn lọc hoặc chọn lọc cao của thạch BCYE+AB (xem B.3) hoặc thạch GVPC (xem B.4) hoặc thạch MWY (xem B.5). Ghi lại thể tích đã cấy.

8.4.4  Mẫu có nồng độ vi sinh vật tạp cao

Nuôi cấy các mẫu có chứa nhiều vi sinh vật tạp chưa được cô đặc (trực tiếp), cô đặc (xem 8.2) hoặc pha loãng (1:10). Chia mỗi mẫu con thành ba phần. Sử dụng một phần mẫu chưa xử lý, phần thứ hai để xử lý bằng nhiệt (xem 8.3.1) và phần thứ ba để xử lý bằng dung dịch axit (xem 8.3.2). Cấy và dàn đều từ 0,1 mL đến 0,5 mL từng phần của các mẫu con trên đĩa thạch GVPC (xem B.4) hoặc đĩa thạch MWY (xem B.5). Ghi lại thể tích đã cấy.

8.4.5  Mẫu có nồng độ vi sinh vật tạp đặc biệt cao

Nuôi cấy mẫu có nồng độ vi sinh vật tạp đặc biệt cao chưa được cô đặc và pha loãng (1:10 và 1:100) sau khi xử lý sơ bộ với sự kết hợp của nhiệt và axit. Đối với xử lý kết hợp, trước tiên xử lý nhiệt (xem 8.3.1) sau đó xử lý bằng axit (xem 8.3.2). Điều quan trọng là phải làm nguội mẫu đã xử lý nhiệt đến nhiệt độ phòng trước khi thực hiện xử lý bằng axit. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng ngay sau khi xử lý bằng axit trong dung dịch pha loãng vô trùng (xem Phụ lục C).

Trộn đều bằng cách lắc, sử dụng máy trộn vortex (5.7) hoặc bể cách thủy có siêu âm (5.8). Nếu cần, thêm một lớp viên bi thủy tinh vô trùng (vừa đủ để phủ đáy vật chứa) vào mẫu để giúp phân tách vật liệu. Cấy và dàn đều từ 0,1 mL đến 0,5 mL từng phần mẫu lên đĩa thạch GVPC (xem B.4) hoặc đĩa thạch MWY (xem B.5). Ghi lại thể tích đã cấy.

8.4.6  Ủ

Để yên các đĩa đã cấy cho đến khi thể tích cấy đã được hấp thụ, sau đó lật ngược các đĩa và ủ ở (36 ± 2) °C trong 7 ngày đến 10 ngày. Ví dụ, tạo bầu không khí ẩm để ngăn các đĩa bị khô bằng cách đặt vào một thùng chứa kín.

CHÚ THÍCH: Dữ liệu đánh giá xác nhận sử dụng các mẫu thêm chuẩn đã chứng minh không có sự khác biệt về số đếm giữa thời gian ủ trong 7 ngày đến 10 ngày. Tuy nhiên, các mẫu tự nhiên có chứa các chủng Legionella hoang dã có thể yêu cầu thời gian ủ đầy đủ là 10 ngày để cho thấy sự phát triển.

8.4.7  Kiểm tra các đĩa

Kiểm tra các đĩa lần đầu tiên vào ngày thứ 2, thứ 3, thứ 4 hoặc thứ 5, sau đó kiểm tra lần cuối vào cuối thời gian ủ. Điều này là để xác định các mẫu khi có sự phát triển quá mức. Kết quả định lượng cuối cùng không có sẵn cho đến khi kết thúc thời gian ủ. Đối với dải định lượng, xem Bảng H.1. Vì Legionella phát triển chậm và có thể bị che lấp bởi sự phát triển của các vi sinh vật khác, do đó nên sử dụng kính hiển vi soi nổi có chiếu sáng xiên (5.11). Ghi lại số lượng từng loại khuẩn lạc Legionella giả định có mặt.

Trong trường hợp điều tra ổ dịch, các mẫu dự kiến có nồng độ vi sinh vật tạp cao thì nên kiểm tra các đĩa vào ngày thứ 2 để xác định xem có cần pha loãng mẫu hay không, cần nhận biết tác động tiêu cực có thể xảy ra của việc bảo quản chất cô đặc hoặc mẫu thêm hai ngày.

Các khuẩn lạc Legionella nhìn chung có màu xám trắng nhưng cũng có thể xuất hiện với các màu khác. Các khuẩn lạc này trơn nhẵn với viền liền nhau và biểu hiện bên ngoài như thủy tinh. Dưới đèn tia cực tím (5.3), các khuẩn lạc của một số loài (L. anisa, L. bozemanii, L. cherrii, L. dumoffii, L. gormanii, L. gratiana, L. parisiensis, L. steigenvaltii và L. tucsonensis) tự phát huỳnh quang màu trắng; L. erythra và L. rubrilucens có màu đỏ. Các khuẩn lạc L. pneumophila có màu xanh lục xỉn thường pha với màu vàng. Ánh sáng huỳnh quang có thể giúp phân biệt các khuẩn lạc trong các mẫu có chứa các loài Legionella khác nhau. Để tránh khả năng các tế bào Legionella có thể bị chết hoặc bị hư hỏng khiến chúng không thể phục hồi được, không nên để đĩa tiếp xúc với tia cực tím trong thời gian lâu hơn mức cần thiết. Cần lưu ý rằng các loài Legionella mới có thể có các đặc điểm khác với những loài được mô tả ở trên.

8.5  Khẳng định các khuẩn lạc Legionella giả định trên môi trường nuôi cấy: thạch BCYE và thạch BCYE-cys

Cấy truyền từ đĩa cho thấy số lượng khuẩn lạc Legionella giả định cao nhất (xem 8.4.7) trên mỗi thể tích nước. Khi chỉ có một loại khuẩn lạc, thì chọn ba khuẩn lạc giả định. Nếu có nhiều loại khuẩn lạc giả định khác nhau về hình thái của Legionella đang phát triển trên đĩa, thì lấy ít nhất một khuẩn lạc từ mỗi loại. Cấy truyền lên đĩa thạch BCYE (xem B.1) và đĩa thạch BCYE-cys (xem B.2 hoặc môi trường thay thế như mô tả trong CHÚ THÍCH ở 6.1.2). Cẩn thận không mang sang môi trường cấy truyền môi trường muôi cấy nào cùng với khuẩn lạc và trước tiên cấy vào đĩa thạch BCYE-cys và sau đó là đĩa thạch BCYE. Ủ ở (36 ± 2) °C trong 2 ngày đến 5 ngày. Legionella được coi là những khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch BCYE (xem B.1) nhưng không phát triển trên đĩa thạch BCYE-cys (xem B.2). Ghi lại kết quả cho từng đĩa. Nếu các chủng cấy truyền ban đầu không khẳng định là Legionella, thì phân tích thêm các các chủng cấy truyền của các khuẩn lạc Legionella giả định từ một loại đĩa khác (môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu).

L. oakridgensris và L. spiritensis cần có L-cysteine và sắt (III) để phân lập ban đầu nhưng đôi khi phát triển yếu khi không có L-cysteine bổ sung sau đó. Do đó, cần phải so sánh cẩn thận sự khác nhau về tốc độ tăng trưởng giữa môi trường nuôi cấy có bổ sung và không bổ sung.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các quy trình thay thế để khẳng định chủng phân lập khi các loài Legionella cung cấp tính phù hợp của quy trình thay thế đã được xác nhận.

Đối với các tình huống đặc biệt như điều tra ổ dịch, ít nhất năm khuẩn lạc giả định nếu chỉ có một hình thái, hoặc hai khuẩn lạc giả định cho mỗi loại hình thái phải được khẳng định. Nếu việc nhận biết các khuẩn lạc Legionella được thực hiện (xem Phụ lục G) và được đưa vào báo cáo thử nghiệm, thì tất cả các hình thái điển hình có mặt trên bất kỳ đĩa nào trong số các đĩa này phải được khẳng định và việc nhận dạng phải được ghi lại.

9  Biểu thị kết quả

Để ước tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc của Legionella trong mẫu nước ban đầu, chọn đĩa hoặc bộ đĩa (từ cùng một môi trường nuôi cấy) cho số lượng tối đa khuẩn lạc đã khẳng định trên một thể tích nước. Có tính đến độ pha loãng. Không tính trung bình số đếm từ các phương pháp, biện pháp xử lý hoặc phương pháp nuôi cấy khác nhau, vì đây không phải là các lần lặp lại.

Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc Legionella trong mẫu gốc (xem các ví dụ minh họa dưới đây) trên lít, theo ISO 8199, như sau:

- Cấy trực tiếp ra đĩa:

- Màng lọc đặt lên đĩa:

- Lọc có quy trình rửa (lọc gián tiếp):

- Cấy ra đĩa sau khi pha loãng:

Trong đó:

C_s là số lượng Legionella tính bằng cfu/L;

α là số khuẩn lạc Legionella đã khẳng định đếm được:

a = (phần khẳng định dương tính / phần khẳng định tổng số) x tổng số đếm

V_c là thể tích mẫu (cô đặc) tính bằng mililít, (mL);

V là thể tích mẫu đã cấy trên đĩa hoặc bộ đĩa (từ cùng một môi trường nuôi cấy), tính bằng mililit, (mL);

V_tot là tổng thể tích mẫu thử nghiệm, tính bằng mililit (mL);

V_s là thể tích chuẩn được chọn để biểu thị nồng độ vi sinh vật trong mẫu (thường là 1 000 mL);

V_dil là thể tích mẫu đã pha loãng được cấy trên đĩa hoặc bộ đĩa (từ cùng một môi trường nuôi cấy) tính bằng mililit (mL);

D_f là hệ số pha loãng.

Mục đích của tiêu chuẩn này là để chứng minh số lượng Legionella được xác nhận trong một mẫu. Báo cáo số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc Legionella đã khẳng định phù hợp với ISO 8199. Báo cáo sự không có mặt là "không được phát hiện" trong thể tích được kiểm tra và chỉ rõ giới hạn phát hiện tính được theo quy trình đã sử dụng (xem Bảng J.1).

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) phương pháp thử được sử dụng (cùng với Phụ lục J), cùng với viện dẫn tiêu chuẩn này;

VÍ DỤ: Các quy định khác, cùng với Phụ lục I có thể được thực hiện như sau: [Nền mẫu A; Quy trình 8, 9, 10; Môi trường A và Môi trường C - GVPC].

b) tất cả các chi tiết cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu, như vị trí lấy mẫu với số nhận dạng duy nhất, để nếu cần, có thể lấy mẫu lặp lại từ vị trí và điểm mẫu chính xác [ví dụ: vị trí tòa nhà (địa chỉ và mã bưu điện), số tầng và phòng, vị trí chính xác của đầu ra (bồn rửa tay trong phòng)], kỹ thuật lấy mẫu, bản chất của mẫu, loại hệ thống nước hoặc nhà máy, nhiệt độ và nồng độ chất diệt khuẩn;

c) ngày và giờ lấy mẫu, ngày nhận mẫu, thời điểm bắt đầu và kết thúc quá trình kiểm tra, bất kỳ sự cố cụ thể nào quan sát được trong quá trình vận chuyển, bảo quản và quá trình phân tích có thể ảnh hưởng đến kết quả (ví dụ: các hạt trong mẫu);

d) thể tích lớn nhất đã được sử dụng trong phép phân tích;

e) các kết quả được biểu thị theo Điều 9.

11  Đảm bảo chất lượng

11.1  Yêu cầu chung

Phòng thử nghiệm phải có hệ thống kiểm soát chất lượng được xác định rõ ràng để đảm bảo rằng thiết bị, thuốc thử và kỹ thuật phù hợp với phép thử. Việc sử dụng các kiểm chứng dương tính, kiểm chứng âm tính và mẫu trắng là một phần của thử nghiệm.

11.2  Phép thử hiệu năng môi trường nuôi cấy Legionella

Đối với định nghĩa về năng suất, độ chọn lọc và tính đặc hiệu, cần tham khảo TCVN 8128 (ISO 11133). Hiệu năng của các môi trường nuôi cấy Legionella khác nhau phải được thử nghiệm theo các phương pháp và tiêu chí mô tả trong TCVN 8128 (ISO 11133). Việc chuẩn bị các mẫu cấy làm việc và huyền phù thử nghiệm được mô tả trong 11.3. Đối với các đĩa thạch BCYE (xem B.1), chỉ có thể kiểm tra năng suất. Đối với các đĩa thạch BCYE-cys (xem B.2 hoặc môi trường thay thế như được mô tả trong CHÚ THÍCH 6.7.2), chỉ kiểm tra xem nó không có khả năng hỗ trợ tăng trưởng với một trong các loài L.neumophila được đề cập trong Bảng 1.

11.3  Chuẩn bị chủng làm việc và huyền phù thử nghiệm cho phép thử hiệu năng

Các chủng làm việc phải được chuẩn bị từ nguồn đối chứng hoặc chủng gốc của loài Legionella. Hoàn nguyên và phục hồi theo khuyến nghị và cấy truyền lên một hoặc một số đĩa thạch BCYE (xem B.1) để có độ tinh khiết. Sau khi ủ, tạo huyền phù trong canh thang glyxerol vô trùng (xem G.2.4) từ phần sinh trưởng thu được sao cho có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phân phối thành các thể tích 1 mL để bảo quản ở (-20 ± 5) °C.

Ngoài ra, sử dụng nước muối của Page (xem C.1) hoặc nước cất để bảo quản ở (-70 ± 10) °C hoặc môi trường nuôi cấy đông lạnh thích hợp khác và bảo quản ở (-20 ± 5) °C hoặc (-70 ± 10) °C nếu thích hợp. Cấy đĩa một huyền phù của mỗi dòng phân lập lên môi trường nuôi cấy Legionella để xác định và ghi lại các loài Legionella. Để sử dụng, cho chủng làm việc của một (hoặc nhiều) chủng phân lập tan băng ở nhiệt độ phòng. Lắc kỹ, đợi 5 min đến 10 min, nếu cần, pha loãng để thu được huyền phù thử nghiệm với số lượng vi sinh vật mong muốn trong một thể tích xác định phù hợp với TCVN 8128 (ISO 11133).

Bảng 1 - Các chủng kiểm chứng và tiêu chí hiệu năng

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các loài Legionella

Chi Legionella thuionellLegionellales, bao gllalesà "kCoxiellaceae và Legionellaceae. Trong hlaLegionellaceae, ba chi khác nhau đã được phát triển" v: Legionella, Fluoribacter và Tatlockla. Tuy nhiên, hai chi liter triển" và "1" nghĩa là "phát triển yếu"ề số chủng thu thập nuôi cấy Legionella đưionellan, hai chi liter triển" và “1” nghĩa là "p

Legionellae là nhellae, hai chi liter triển" và “1” nghĩa là "phát triển yếu"ề số chủng thu thập nurbohydrat được sử dụng làm nguồn năng lượng. Legionellae là nhellae, hai chi liter triển" và “1” nghĩa là "phát triển yếu"ề số°C đ nhell°C.

Axit amin L-cysteine cit amin L-cysteine liter triển" và “1” nghĩa là "Legionella tgionellaL-cysteine liter triển" và "1" nghĩa là L. oakridgensis và L. spiritensis c. spiritensis eine và iron(IIII) đ eine liter triển" và "1" nghĩa là "phát triển yếu"ề số chủng thu thập b iron(IIII) đ eine liter triển" và "1" nghĩa là "phát triển yi ưu và để phân lập ban đầu vi khuẩn từ cả nguồn bệnh và môi trường, sắt(III), L-cysteine, α- ketoglutarate và thạch chất chiết nấm men chứa than đệm bằng dung dịch đệm hữu cơ (thạch BCYE) là môi trường nuôi cấy tăng trưởng được ưa thích để phân lập lâm sàng. Quan trọng về mặt lâm sàng, các loài Legionella phát triall) đ eine liter°C trong không khí ne liter triển" và "1" nghĩa là "phát triển yi ưu và để phân lập ban đầu vi khuẩn từ cả nguồn bLegionella, L. lytica không tha, L. lyticaliter triển" và "1" nghĩ có thể được nuôi cấy sử dụng đồng nuôi cấy với amip.

ít nhg tha, L. ILegionella khác nhau đã đưyticaliter triển" và "1" nghĩ có thể được nuôi cấy sử dụng đồng nuôi cấy với amip.ẩnLegionella pneumophila chionella pneumophilaiter triển" và "1" ng; chín loài khác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được nuôi cấy sử dụng đồng nuôi cấy với amip.ẩn từ cả nguồn bệnh và môi trường L. Pneumophlla 1 đã gây ra vác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được nuôi cấy sử dụng đồng nuôi cấy với amip.ẩn từ cả nguồn bệnh Legionnaires có một chủng vi khuẩn phân lập được. Giống như L. Pneumophila, các loài Legionella khác phân bilaác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được nuôi cấy sử dụng đồng nuôi cấy với amip.ẩn từ cả nguồn bệbệnh Legionnaires có một chủng vi khuẩn pi của L.neumophila. 25 loài Legionella khác vll L.neumophila đã đưumophila ác chilaiter triển" và “1" nghĩ có thể được nuôi cấy sử dụng đồng nuôi cấy với amip.ẩn từ cả nguồn bệbệnh Legionnaires có một chủng vi khuẩn pi của p được. Giống như chất chiết nấm mg số chúng đã liên quan đến sự lây nhiễm của con người dựa trên sự chuyển đổi huyết thanh trong trường hợp không được phân lập.

Khi phát tria ác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được nuôi Legionella tegionella ia ác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được quang màu xanh lục vàng khi tiếp xúc với ánh sáng cực tím sóng dài (360 ± 20) nm. Một số loài biểu hiện sự tự phát huỳnh quang màu trắng xanh hoặc đỏ dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Via ác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được quang màu xanh lục vàng khi phòng thí nghiệm bằng cách nhuộm kháng thể huỳnh quang trực tiếp của các chủng phân lập. Việc xác định các nhóm huyết thanh L.neumophila và các loài Legionella khác thưla ác chilaiter triển" và "1" nghĩ có thể được quang màu xanh lục vàng khi phòng thí nghiệm. Việc xác định bằng kỹ thuật phân tử là phương pháp cuối cùng, đặc biệt là đối với các chủng ít phổ biến hơn.

Bhác thưla ác chiLegionella gây bnel

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy

B.1  Thạch chất chiết nấm men than (BCYE)

B.1.1  Thành phần

Kiểm tra các khuyến nghị của nhà sản xuất về nồng độ thạch được thêm vào để cung cấp đủ cường độ tạo gel. Tất cả nước được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy và chất bổ sung phải phù hợp với các yêu cầu của loại 3 trong TCVN 4851 (ISO 3696) (xem Điều 6).

B.1.2  Chuẩn bị

a) Dung dịch cysteine và sắt(lll)

Chuẩn bị dung dịch mới của L-cystein hydroclorid và sắt (III) pyrophosphat bằng cách cho lần lượt 0,4 g và 0,25 g vào 10 mL nước. Khử trùng từng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Bảo quản trong vật chứa sạch vô trùng ở (-20 ± 3) °C không quá 3 tháng.

b) Đệm ACES

Cho các hạt ACES vào 500 mL nước và hòa tan bằng cách để trong bể cách thủy ở 45 °C đến 50 °C. Lấy 480 mL nước, cho tất cả các viên kali hydroxit vào và hòa tan bằng cách lắc nhẹ. Để chuẩn bị dung dịch đệm ACES, trộn đều hai dung dịch.

c) Môi trường nuôi cấy cuối cùng

Cho lần lượt vào 980 mL dung dịch đệm ACES than củi, chất chiết nấm men và α-ketoglutarate.

CHÚ THÍCH: Dung dịch đệm ACES có thể làm biến tính chất chiết nấm men nếu không tuân theo trình tự quy định.

Chuẩn bị dung dịch kali hydroxit (KOH) 0,1 mol/L bằng cách hòa tan 5,6 g chế phẩm trong 1 L nước. Chuẩn bị dung dịch axit sunfuric (H₂SO₄) 0,1 mol/L bằng cách thêm cẩn thận 5,5 mL H₂SO₄ (95 % đến 98 %) vào 1 L nước, sử dụng các dung dịch kali hydroxit 0,1 mol/L hoặc axit sulfuric 0,1 mol/L tùy chọn để chỉnh pH đến 6,8 ± 0,2. Thêm agar, trộn và hấp ở nhiệt độ (121 ± 3) °C trong (15 ± 1) min. Sau khi hấp, để nguội đến (48 ± 3) °C trong bể cách thủy.

Thêm L-cystein và sắt(lll) pyrophosphat trong điều kiện vô trùng, trộn đều giữa các lần bổ sung.

Phân phối các lượng 20 mL vào các đĩa Petri có đường kính từ 90 mm đến 100 mm. PH của môi trường nuôi cấy cuối cùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Để khô độ ẩm dư trên đĩa và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong hộp kín, nơi tối đến 3 tháng.

B.2  Thạch chất chiết nấm men than không có L-cysteine (BCYE-cys)

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy này theo cách giống với thạch BCYE (xem B.1) nhưng bỏ qua L-cystein.

Để khô độ ẩm dư trên đĩa và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong hộp kín, nơi tối đến 3 tháng.

B.3  Môi trường nuôi cấy chọn lọc: Thạch chất chiết nấm men than với các chất bổ sung chọn lọc (BCYE + AB)

B.3.1  Các chất bổ sung chọn lọc

Nồng độ cuối cùng của các chất bổ sung chọn lọc trong thạch BCYE + AB phải như sau:

CHÚ THÍCH: Môi trường nuôi cấy này giống với thạch BCYE (xem E.1) ngoại trừ việc ba chất bổ sung kháng sinh được thêm vào thạch BCYE.

B.3.2  Chuẩn bị các chất bổ sung kháng sinh

Cho một lượng polymyxin B sulfat thích hợp vào 100 mL nước để thu được nồng độ 14 545 lU/mL. Khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 5,5 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

Cho 180 mg natri cefazolin vào 20 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 1 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

Cho 1,75 g pimaricin vào 100 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 4 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

B.3.3  Chuẩn bị thạch BCYE + AB

Sau khi thêm dung dịch L-cystein và dung dịch sắt (III) pyrophosphat, thêm tch L-cystein và dung dịch sắt (III) ở nhiệt độ phòng qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc

Phân phsphat, thêm tch L-cystein và dung dịch sắt (III) ở nhiệt độ ph mm. PH của môi trường nuôi cấy cuối cùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Để khô lượng ẩm dư trên đĩa và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong hộp kín, nơi tối đến 3 tháng.

B.4  Môi trường nuôi cấy chọn lọc cao: thạch glycine vancomycin polymyxin B cycloheximide (GVPC)

B.4.1  Các chất bổ sung có chọn lọc

Nồng độ cuối cùng của các chất bổ sung chọn lọc trong thạch GVPC phải như sau:

CHÚ THÍCH: Môi trường nuôi cấy này giống với thạch BCYE (xem B.1) ngoại trừ việc ba chất bổ sung kháng sinh và glycine được thêm vào thạch BCYE.

B.4.2  Chuẩn bị các chất bổ sung kháng sinh

Cho một lượng polymyxin B sulfat thích hợp vào 100 mL nước để có được nồng độ 14 545 lU/mL. Khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 5,5 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

Cho 20 mg vancomycin hydroclorua vào 20 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 1 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

Cho 2 g cycloheximide vào 100 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 4 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

CẢNH BÁO - Cycloheximide gây độc cho gan. Mang găng tay và khẩu trang chống bụi khi xử lý hóa chất này ở dạng bột.

B.4.3  Chuẩn bị thạch GVPC

Chuẩn bị thạch BCYE theo hướng dẫn nêu trong B.1, nhưng thêm 3 g glyxin không chứa amoni sau khi thêm α-ketoglutarate và sau đó chỉnh pH đến 6,8 ± 0,2.

Sau khi bổ sung dung dịch pyrophosphat L-cystein và sắt (III), thêm một lượng xác định của mỗi chất trong số ba chất bổ sung kháng sinh ở trên (xem B.4.2) vào môi trường nuôi cấy cuối cùng. Trộn đều.

Phân phối các lượng 20 mL vào các đĩa Petri có đường kính từ 90 mm đến 100 mm. PH của môi trường nuôi cấy cuối cùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Để khô độ ẩm dư thừa trên đĩa và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong hộp kín, nơi tối đến 4 tuần.

B.5  Môi trường nuôi cấy chọn lọc cao: Thạch Wadowsky Yee (MWY) đã cải biến

B.5.1  Các chất bổ sung có chọn lọc

Nồng độ cuối cùng của các chất bổ sung chọn lọc trong thạch MWY phải như sau:

B.5.2  Chuẩn bị các chất bổ sung kháng sinh

Cho một lượng polymyxin B sulfat thích hợp vào 100 mL nước để đạt được nồng độ 10 000 lU/mL. Khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 5 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

Cho 20 mg vancomycin hydroclorua vào 20 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 1 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (-20 ± 3) °C trong thời gian không quá 3 tháng. Để sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng.

Cho 0,1 g anisomycin vào 10 mL etanol (xem Điều 6) và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 0,8 mL vào các vật chứa vô trùng, sử dụng dung dịch anisomycin mới chuẩn bị.

Cho 100 mg bromothymol xanh (blue) vào 100 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 10 mL vào các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong thời gian tối đa là 1 năm.

Cho 100 mg bromocresol tím vào 100 mL nước và khử trùng dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng có cỡ lỗ trung bình 0,2 µm hoặc cỡ lỗ nhỏ hơn. Phân phối các lượng 10 mL trong các vật chứa vô trùng và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong thời gian tối đa là 1 năm.

B.5.3  Chuẩn bị thạch MWY

Thực hiện theo hướng dẫn chuẩn bị thạch BCYE như trong B.1, nhưng thêm 3 g glyxin không chứa amoni sau khi thêm α-ketoglutarate và sau đó chỉnh pH đến 6,8 ± 0,2.

Sau khi thêm dung dịch L-cystein và dung dịch sắt (III) pyrophosphat, thêm 5 mL polymyxin B sulfat, 1 mL vancomycin hydroclorid, 0,8 mL dung dịch anisomycin và 10 mL cả hai chất chỉ thị (xem B.5.2) vào môi trường nuôi cấy cuối cùng. Trộn đều.

Phân phối các thể tích 20 mL vào các đĩa Petri có đường kính từ 90 mm đến 100 mm. PH của môi trường nuôi cấy cuối cùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Để khô lượng ẩm dư thừa trên đĩa và bảo quản ở (5 ± 3) °C trong vật chứa kín khí, nơi tối đến 4 tuần.

B.6  Thạch máu

B.6.1  Thành phần

Kiểm tra các khuyến nghị của nhà sản xuất về sức đông của thạch được thêm vào để cung cấp đủ cường độ tạo gel. Nước được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy và chất bổ sung phải phù hợp với các yêu cầu loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696), (xem Điều 6).

B.6.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần, trừ máu, trong nước và trộn đều. Nếu cần, chỉnh pH sao cho pH sau khi tiệt trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Hấp tiệt trùng ở (121 ± 3) °C trong (15 ± 1) min. Sau khi tiệt trùng, để nguội đến (48 ± 3) °C trong bể cách thủy. Thêm 50 mL máu, trộn đều và đổ vào đĩa Petri đến độ sâu ít nhất là 4 mm. Nếu không sử dụng ngay, các đĩa này có thể được bảo quản ở (5 ± 3) °C ở nơi tối và tránh bay hơi trong tối đa 4 tuần.

B.7  Thạch dinh dưỡng

B.7.1  Thành phần

Kiểm tra khuyến nghị của nhà sản xuất về sức đông của thạch được thêm vào để cung cấp đủ cường độ tạo gel. Nước được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy và chất bổ sung phải phù hợp với các yêu cầu loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696), (xem Điều 6).

B.7.2  Chuẩn bị

Cho các nguyên liệu vào nước và trộn đều. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi tiệt trùng, pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Hấp tiệt trùng ở (121 ± 3) °C trong (15 ± 1) min. Sau khi tiệt trùng, để nguội đến (48 ± 3) °C và đổ vào đĩa Petri đến độ sâu ít nhất là 4 mm. Nếu không sử dụng ngay, có thể bảo quản các đĩa này nơi tối ở (5 ± 3) °C và tránh bay hơi trong ít nhất 8 tuần.

B.8  Thạch trypton đậu tương (TSA)

B.8.1  Thành phần

Kiểm tra các khuyến nghị của nhà sản xuất về sức đông thạch được thêm vào để cung cấp đủ cường độ tạo gel. Nước được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy và chất bổ sung phải phù hợp với các yêu cầu loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696), (xem Điều 6).

B.8.2  Chuẩn bị

Cho các nguyên liệu vào nước và trộn đều. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi tiệt trùng, pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Hấp tiệt trùng ở (121 ± 3) °C trong (15 ± 1) min. Sau khi tiệt trùng, để nguội đến (48 ± 3) °C và đổ vào đĩa Petri đến độ sâu ít nhất là 4 mm. Nếu không sử dụng ngay, có thể bảo quản các đĩa này nơi tối ở (5 ± 3) °C và tránh bay hơi trong ít nhất 8 tuần.

Phụ lục C

(Quy định)

Chất pha loãng

C.1  Nước muối Page

C.1.1  Thành phần

Thêm hóa chất vào nước. Để hòa tan, trộn đều và hấp áp lực ở (121 ± 3) °C trong (15 ± 1) min.

CHÚ THÍCH: Để chuẩn bị chính xác, có thể chuẩn bị 10 L dung dịch muối Page và phân phối các lượng nhỏ hơn theo yêu cầu để hấp áp lực ở (121 ± 3) °C trong (20 ± 1) min.

C.2  Dung dịch Ringer pha loãng

Sử dụng độ pha loãng 1:10 của dung dịch Ringer nồng độ 1/4 như được mô tả trong ISO 8199.

C.3  Nước muối đệm phosphat (PBS) (pH 7,5)

Sử dụng chế phẩm bán sẵn trên thị trường và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.4  Nước vòi vô trùng

Sử dụng nước vòi vô trùng đã được chứng minh là không ảnh hưởng đến sự phục hồi của Legionella.

TCVN 13451:2021

Phụ lục D

(Quy định)

Dung dịch axit

Chuẩn bị dung dịch axit clohydric (HCl) 0,2 mol bằng cách cho 17,4 ml. HCl đặc (ρ = 1,184, tối thiểu 37 %) hoặc 20 mL HCl đặc (ρ = 1,16, tối thiểu 31,5 %) vào 1 L nước (dung dịch A).

Chuẩn bị dung dịch kali clorua (KCl) 0,2 mol/L bằng cách hòa tan 14,9 g KCl trong 1 L nước (dung dịch B).

Để chuẩn bị dung dịch axit, trộn 3,9 mL dung dịch A và 25 mL dung dịch B. Chỉnh đến pH 2,2 ± 0,2 bằng cách thêm dung dịch kali hydroxit (KOH) 1 mol/L. Bảo quản trong lọ thủy tinh nơi tối ở nhiệt độ phòng không quá 1 tháng.

Phụ lục E

(tham khảo)

Cạo hoặc nạo vét vi khuẩn ra khỏi màng lọc

Có thể sử dụng phương pháp cạo để lấy Legionella ra khỏi màng lọc.

Bộ lọc màng được lấy ra khỏi giá đỡ bằng kẹp đã khử trùng và đặt vào đĩa Petri vô trùng có kích thước phù hợp (thường là đĩa Petri có đường kính 60 mm đối với màng 47 mm) có chứa từ 5 mL đến 10 mL dung dịch lọc hoặc dịch lọc vô trùng từ mẫu ban đầu. Ghi lại thể tích đã sử dụng. Màng lọc sau đó được cạo một vài lần bằng dụng cụ cạo tế bào vô trùng (có bán trên thị trường).

Phụ lục F

(tham khảo)

Kỹ thuật ly tâm

Nếu có nhiều cặn lắng trong mẫu đến mức không thể cô đặc bằng cách lọc thì có thể sử dụng kỹ thuật ly tâm. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp này thường thấp hơn nhiều so với các kỹ thuật khác được nêu trong tiêu chuẩn này. Tỷ lệ thu hồi là tốt nhất với roto cánh quạt văng vì cặn lắng được hạn chế ở đáy ống, giúp dễ dàng loại bỏ phần nổi phía trên mà không làm ảnh hưởng đến cặn lắng. Tỷ lệ thu hồi với rôto góc không ổn định và thấp hơn so với các kỹ thuật khác trong tiêu chuẩn này.

Sau khi lắc để hòa lại chất lắng bất kỳ, rót (200 ± 5) mL từng mẫu vào các chai ly tâm có nắp vặn vô trùng có dung tích từ 300 mL đến 500 mL. Ly tâm các chai ở 6000g trong 10 min hoặc 3000 g trong 30 min, duy trì nhiệt độ ở 15 °C đến 25 °C. Tháo đầu ly tâm đã bịt kín với các chai chứa bên trong vào tủ an toàn trước bật roto. Điều này giúp tránh tiếp xúc với sol khí nếu chai bị vỡ trong quá trình ly tâm. Loại bỏ phần nổi phía trên một cách vô trùng và loại bỏ. Hòa lại cặn trong 2 mL đến 10 mL chất pha loãng (xem Phụ lục C). Cần ghi lại thể tích chất pha loãng đã thêm vào. Phần cô đặc này đại diện cho mẫu đã chuẩn bị. Nên loại bỏ phần nổi phía trên bằng chân không, thay vì gạn, để tránh xáo trộn và dẫn đến thất thoát cặn. Nếu cần, có thể sử dụng một lượng nhỏ mẫu để điều chỉnh thể tích chất pha loãng để hòa lại.

Phụ lục G

(Tham khảo)

Phân tích kháng thể huỳnh quang miễn dịch gián tiếp để xác định các loài Legionella

G.1  Yêu cầu chung

Các loài Legionella có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm kỹ thuật sắc ký khí-lỏng các axit béo tế bào và quinon isoprenozel, phân tích kháng thể huỳnh quang miễn dịch gián tiếp, phân tích kháng thể huỳnh quang trực tiếp, ngưng kết phiến kính, ngưng kết hạt latex, phân tích đốm màu khuẩn lạc dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu, phép phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết enzym với thuốc thử chẩn đoán thích hợp, matrix assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDITOF) (MALDITOF), phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và trình tự DNA. Trong phụ lục này, phương pháp miễn dịch huỳnh quang được mô tả như một ví dụ về phương pháp huyết thanh học, có thể được sử dụng để xác định các loài Legionella.

G.2  Thuốc thử (huyết thanh học)

Sử dụng thuốc thử huyết thanh chẩn đoán có độ đặc hiệu đã biết từ nguồn đã biết. Không sử dụng thuốc thử không có sẵn thông tin này.

CHÚ THÍCH: Đôi khi có thể xảy ra phản ứng chéo huyết thanh học với các vi sinh vật khác trong mẫu môi trường.

G.2.1 Kháng huyết thanh với L.neumophila và các loài Legionella khác

Để xác định L. pneumophila, sử dụng các chế phẩm kháng thể đa dòng hoặc đơn dòng để phản ứng với tất cả các nhóm huyết thanh đã biết của L. pneumophila, sử dụng kháng huyết thanh cụ thể, nếu cần thiết, để xác định các loài khác với L. pneumophila hoặc các nhóm huyết thanh của L. pneumoniaophila.

G.2.2  Fluorescein isothiocyanate anti-rabbit conjugate (FITC)

Sử dụng FITC để kháng lại các protein huyết thanh thỏ có bán trên thị trường. Các chất cộng hợp (conjugate) khác nhau cần sử dụng với kháng huyết thanh ở các động vật khác.

G.2.3  Môi trường có glyxerol

Sử dụng môi trường có glyxerol có bán trên thị trường, hoặc chuẩn bị bằng cách cho 1 mL dung dịch muối đệm kali phosphat (pH 8,5) vào 9 mL glyxerol (trung tính).

G.2.4  Canh thang glyxerol

Hòa tan 5 g canh thang dinh dưỡng khan có bán sẵn trên thị trường vào 170 mL nước (xem Điều 6) và thêm 30 mL glyxerol. Trộn đều và phân phối vào các chai thủy tinh silica khô, sạch với các lượng 2 mL.

Khử trùng bằng cách hấp ở (121 ± 3) °C trong (20 ± 1) min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi cần dùng.

G.2.5  Dung dịch muối formol

Chuẩn bị bằng cách cho 20 ml dung dịch nước chứa 37 % fomandehyd vào 980 mL dung dịch muối đệm phosphat (xem C.3).

G.3  Chuẩn bị kháng nguyên

Sử dụng Legionella thuần khiết đã phân lập được vào các đĩa thạch BCYE (xem 8.5), chuẩn bị kháng nguyên thử nghiệm (mẫu) bằng cách nhũ hóa một số khuẩn lạc trong nước muối formol (xem G.2.5).

Đối với một số thuốc thử, việc sử dụng dung dịch muối formol có thể không thích hợp, trong trường hợp đó, các khuẩn lạc có thể bị nhũ hóa trong nước (xem Điều 6) và huyền phù bị bất hoạt ở 60 °C trong (60 ± 5) min. Cần phải xác định xem phương pháp chuẩn bị nào có thể áp dụng được.

Pha loãng kháng nguyên thử nghiệm trong nước muối đệm phosphat (PBS) (xem C.3) để tạo ra huyền phù, huyền phù này có màu đục mờ khi nhìn bằng mắt thường.

Điều này tương ứng với khoảng 1 x 10⁵ tế bào/mL đến 1 x 10⁶ tế bào/mL và với mật độ quang 0,1 bằng cách sử dụng quang phổ kế ở bước sóng 395 nm với cuvet có chiều dài đường quang 10 mm.

Chuẩn bị kháng nguyên kiểm chứng Legionella theo cách tương tự từ chủng đối chứng thu được từ bộ sưu tập chủng cấy đã được công nhận (ví dụ: Bộ sưu tập quốc gia về chủng cấy) được nuôi cấy trên thạch BCYE. Bảo quản đông lạnh chủng đối chứng như mô tả trong TCVN (ISO 11133).

G.4  Chuẩn bị các phiến kính

Sử dụng các phiến kính phủ polytetrafluoroethylen có nhiều giếng có đường kính 3 mm. Thêm 5 µL mỗi kháng nguyên (xem G3) vào các giếng riêng biệt và để khô. Cố định bằng cách làm nóng nhẹ trên ngọn lửa Bunsen hoặc ngâm 10 min trong axeton.

G.5  Chuẩn bị kháng huyết thanh (kháng thể)

Pha loãng kháng huyết thanh Legionella (xem G.2.1) độ chuẩn độ làm việc khuyến cáo theo hướng dẫn của nhà cung cấp. Thêm đủ kháng huyết thanh đã pha loãng phủ lên từng giếng có chứa kháng nguyên. Đặt phiến kính trong hộp nhựa hoặc hộp thủy tinh có chứa khăn giấy ẩm hoặc giấy thấm để tránh làm khô.

Đậy nắp hộp và ủ ở nhiệt độ (36 ± 2) °C trong (30 ± 1) min.

CHÚ THÍCH: Các mẫu lặp lại của cùng kháng nguyên thử nghiệm có thể được kiểm tra trên một phiến kính, nhưng để tránh nguy cơ lây nhiễm chéo bởi thuốc thử hoặc mẫu, nên sử dụng các phiến kính riêng biệt cho các kháng nguyên thử nghiệm khác nhau (mẫu).

G.6  Rửa các phiến kính

Nhúng các phiến kính vào nước muối đệm phosphat (xem C.3) trong máy trộn quay và rửa nhẹ trong (5 ± 1) min; thay bằng nước muối đệm phosphat mới và rửa lại trong (5 ± 1 ) min; rửa lặp lại một lần nữa trong (5 ± 1) min.

G.7  Sử dụng chất cộng hợp

Pha loãng chất fluorescein isothiocyanate anti-rabbit conjugate (FITC) (xem G.2.2) đến độ chuẩn làm việc theo hướng dẫn của nhà cung cấp. Thêm 5 µl FITC đã pha loãng vào mỗi giếng và ủ trong hộp ẩm ướt ở ( 36 ± 2) °C trong (tối thiểu 30 ± 1) min. Tráng rửa các phiến kính như trong G.6.

G.8  Gắn các vật kính (slide)

Cho vào mỗi phiến kính một lượng vừa đủ (thường là hai đến ba giọt) môi trường có glycerol (xem G.2.3) để phủ khắp kính phủ đủ lớn để che được tất cả các giếng. Đảm bảo rằng không có bọt khí nào lẫn giữa vật kính và kính phủ).

G.9  Kiểm tra các vật kính

Kiểm tra các vật kính bằng kính hiển vi huỳnh quang. Coi các tế bào phát huỳnh quang màu xanh lục sáng với kháng huyết thanh đặc đặc hiệu của loài như các loài Legionella được khẳng định. Lặp lại thử nghiệm với thuốc thử mới nếu không có hiện tượng huỳnh quang xảy ra với các kháng nguyên kiểm chứng.

Nếu các kháng nguyên kiểm chứng không phát huỳnh quang, thì kiểm tra nồng độ làm việc của kháng huyết thanh bằng cách chuẩn bị các dung dịch pha loãng liên tiếp hai lần và chuẩn độ các kháng nguyên kiểm chứng.

Nếu xảy ra phản ứng chéo hoặc kết quả không thể kết luận được, thì các chủng phân lập có thể được gửi đến phòng thí nghiệm chuẩn để kiểm tra thêm. Phương pháp đóng gói để vận chuyển phải phù hợp với các quy định an toàn liên quan.

Phụ lục H

(tham khảo)

Dữ liệu về hiệu năng

Vài phép thử đã được thực hiện để xác định các đặc tính hiệu năng của quy trình này (xem Điều 8). Các kết quả từ một thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và ba nghiên cứu liên phòng thí nghiệm được tóm tắt trong Bảng H.1 và Bảng H.2. Trong phép thử phòng thí nghiệm, được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vitens ở Leeuwarden (Hà Lan), các thông số hiệu năng như dải định lượng, thời gian ủ, độ không đảm bảo đo, độ chính xác, nhận dạng (các đặc tính hiệu năng phân loại) và độ thu hồi đã được xác định. Dữ liệu được tóm tắt trong Bảng H.1.

Các mẫu được sử dụng để xác định các đặc tính hiệu năng chủ yếu là nước ăn uống và nước lấy từ các tháp làm mát. Dữ liệu để xác định các đặc tính hiệu năng phù hợp với ISO 13843^[1]. Các quy trình xác định cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chọn lọc và hiệu quả cao, với tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả thấp. Các đặc tính hiệu năng này thu được trong phòng thí nghiệm, nơi có nhiều kinh nghiệm trong việc xác định loài Legionella trong các mẫu nước. Các phòng thử nghiệm có thể cần thực hiện việc đánh giá xác nhận thứ cấp riêng để xác định các đặc tính hiệu năng của họ.

Thời gian ủ được đánh giá bằng cách sử dụng 147 số đếm thu được, sau 7 ngày và 10 ngày ủ, từ ba phòng thí nghiệm khác nhau. Khi xác định độ chắc chắn dựa trên dữ liệu từ thử nghiệm liên phòng thử nghiệm, chúng có thể không đại diện cho các mẫu tự nhiên không thêm chuẩn.

Ba loài Legionella khác (L.anisa, L. gormanii và L.neumophila) và bốn môi trường nuôi cấy khác nhau đã được sử dụng để tính sự phục hồi. Thạch BCYE được sử dụng làm môi trường nuôi cấy không chọn lọc và thạch BCYE + AB, thạch GVPC và thạch MWY được sử dụng làm môi trường nuôi cấy chọn lọc. Độ thu hồi trung bình thấp nhất được tìm thấy đối với L. gormanii trên thạch GVPC (64 %).

Tháng 3 năm 2015, một nghiên cứu liên phòng với 27 phòng thí nghiệm từ 10 quốc gia đã được thực hiện (Áo, Síp, Phần Lan, Đức, Ý, Hà Lan, Tây Ban Nha, Thụy Sĩ, Vương quốc Anh, Hoa Kỳ) để điều tra độ chụm của phương pháp. Các mẫu được sử dụng trong thử nghiệm liên phòng được bổ sung các loài Legionella khác nhau và nồng độ vi sinh vật gây cản tạp khác nhau. Các mẫu được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp cấy đĩa trực tiếp, đặt màng lọc lên môi trường nuôi cấy, lọc màng tiếp theo là quy trình rửa và cấy ra đĩa sau khi pha loãng mẫu. Các cách xử lý trước khác nhau của mẫu cũng được thực hiện khi có thể. Môi trường nuôi cấy được cung cấp cho tất cả các bên tham gia, do đó các bên tham gia sử dụng các lô môi trường nuôi cấy giống nhau.

Do sự thay đổi trong cách xử lý bằng axit được sử dụng làm bước xử lý sơ bộ cho các phép phân tích Legionella, một nghiên cứu liên phòng thứ hai đã được thực hiện vào tháng 6 năm 2015. Trong nghiên cứu liên phòng này, 8 phòng thí nghiệm từ 3 quốc gia đã tham gia (Áo, Đức, Hà Lan) thực hiện. Các mẫu được sử dụng trong thử nghiệm liên phòng thử nghiệm đã được bổ sung các loài Legionella khác nhau và các nồng độ vi sinh vật tạp khác nhau. Các mẫu được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp lọc màng được đặt trực tiếp màng lọc lên môi trường nuôi cấy, quy trình lọc màng tiếp theo là quy trình rửa và cấy đĩa sau khi pha loãng mẫu. Các biện pháp xử lý trước khác nhau của mẫu cũng được thực hiện khi có thể.

Độ lặp lại của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm thứ hai dao động trong dải từ 18,0 % đến 29,5 % so với dải từ 30,1 % đến 35,3 % thu được trong nghiên cứu đầu tiên. Hiệu suất của độ tái lập tốt hơn trong nghiên cứu liên phòng thứ hai. Độ tái lập trong nghiên cứu thứ hai dao động từ 46,0 % đến 54,0 % so với 56,4 % đến 78,5 % trong nghiên cứu liên phòng đầu tiên. Điều này có thể là do số lượng các bên tham gia ít hơn và khoảng cách vận chuyển mẫu ngắn hơn trong nghiên cứu thứ hai.

Một nghiên cứu liên phòng thứ ba là cần thiết để tính được các đặc tính hiệu năng của phương pháp sử dụng phương pháp lọc màng với việc đặt trực tiếp màng lọc lên môi trường nuôi cấy. Trong nghiên cứu liên phòng thí nghiệm này được thực hiện vào tháng 6 năm 2016, có 10 phòng thí nghiệm từ 4 quốc gia tham gia (Áo, Đức, Hà Lan, Vương quốc Anh). Hai mẫu được sử dụng trong thử nghiệm liên phòng này được phân loại với các loài Legionella khác nhau. Các mẫu được phân tích bằng phương pháp lọc màng với việc đặt trực tiếp màng lọc lên môi trường nuôi cấy. Việc xử lý trước mẫu bằng dung dịch axit cũng được thực hiện khi có thể.

Trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm thứ ba của mẫu đã bổ sung L. Pneumophila, thì độ lặp lại là 51,1 % và độ tái lập là 65,9 %. Mẫu khác có chứa L. anisa không cho thấy sự phát triển trên bộ lọc màng ở bảy phòng thí nghiệm. Có sự phát triển quan sát thấy ở ba phòng thí nghiệm với nồng độ tối đa là 900 cfu/L. Một phòng thí nghiệm đã thực hiện phương pháp cấy trực tiếp đối với mẫu này, nồng độ được tìm thấy với phương pháp cấy trực tiếp là 36 000 cfu/L. Điều này cho thấy, trong trường hợp này, màng lọc có ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển của L. anisa trên màng lọc.

Dữ liệu được tóm tắt trong Bảng H.1 và Bảng H.2.

Bảng H.1 - Các thông số đặc tính hiệu năng của phép thử trong phòng thí nghiệm

Phép thử trong phòng thí nghiệm

a Từ phép thử liên phòng thí nghiệm

b Độ lệch chuẩn hoạt động tương đối trung bình trong các điều kiện tái lập trong phòng thí nghiệm được quan sát trong quá trình mô tả đặc tính đã không khác với giá trị zero (trường hợp lý tưởng) đáng kể.

c Các đặc tính hiệu năng của việc nhận biết cũng được tính toán dựa trên việc khẳng định bằng PCR. Bên cạnh việc khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ bằng cách cấy truyền lên thạch BCYE và thạch BCYE-cys, các khuẩn lạc này cũng được khẳng định bằng phương pháp PCR trong phòng thí nghiệm đã được công nhận theo ISO/IEC 17025. Sự khác biệt nhỏ của việc xác định là do các khuẩn lạc đích và không phải đích phát triển xâm lấn nhau quá mức.

Bảng H.2 - Các thông số đặc tính hiệu năng của phép thử liên phòng thí nghiệm

Phép thử liên phòng thí nghiệm

Độ chụm (RSD) - cấy trực tiếp lên đĩa, nồng độ các vi sinh vật tạp thấp (xem 8.4.2) (n = 24)

Phụ lục I

(Tham khảo)

Xử lý sơ bộ các nền mẫu liên quan đến nước

Các nền mẫu liên quan đến nước bao gồm, ví dụ, tăm bông, trầm tích, màng sinh học, vật liệu lọc từ bộ lọc xử lý nước (cát, than hoạt tính dạng hạt, v.v...).

Việc xử lý sơ bộ mẫu liên quan đến nước phụ thuộc vào loại mẫu. Trong phụ lục này, các ví dụ được mô tả về các nền mẫu liên quan đến nước thường được sử dụng.

VÍ DỤ 1 Tăm bông: Để phân tích bán định lượng, phết lên một diện tích nhất định (ví dụ khoảng 10 cm x 10 cm = 100 cm²). Tăm bông được chuyển vào ống đựng chất pha loãng thích hợp. Đảm bảo phần bông được nhúng hoàn toàn trong chất pha loãng. Trộn kỹ sử dụng máy trộn vortex hoặc dùng bể cách thủy siêu âm trong 2 min. Sau đó huyền phù được tiếp tục sử dụng trong quy trình đối với các nền mẫu liên quan đến nước. Kết quả có thể được biểu thị bằng số đếm trên 100 cm². Nếu diện tích được phết bằng tăm bông không được xác định, ví dụ như trong trường hợp bề mặt không đều, thì ghi lại số lượng trên mỗi miếng tăm bông.

VÍ DỤ 2 Trầm tích hoặc vật liệu rắn khác: Chuyển một cách vô trùng từ 0,1 g đến 10,0 g vật liệu cần kiểm tra vào một ống đựng một lượng chất pha loãng thích hợp tính bằng mililit lớn gấp chín lần khối lượng mẫu tính bằng gam (ví dụ từ 0,9 mL đến 90,0 mL). Trộn kỹ sử dụng máy trộn vortex hoặc dùng bể cách thủy siêu âm trong 2 min. Sau đó, huyền phù tiếp tục được sử dụng trong quy trình đối với các nền mẫu liên quan đến nước.

Phụ lục J

(Quy định)

Nền mẫu quyết định việc chọn phương pháp

Việc chọn phương pháp được sử dụng để định lượng các loài Legionella phụ thuộc vào nguồn gốc/đặc tính của mẫu và lý do lấy mẫu hoặc điều tra. Khi đã biết giới hạn dưới mong muốn của mức phát hiện đối với mẫu, thì điều này đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp thích hợp nhất.

Quyết định chọn phương pháp (xem Hình J.1) tóm tắt tất cả các loại nước có thể có (mẫu), phương pháp, biện pháp xử lý và môi trường nuôi cấy. Điều 8 và nội dung của phụ lục này cung cấp thêm thông tin cơ bản. Các bước sau đây phải được tuân thủ (Bảng J.3 đưa ra các ví dụ).

Bước đầu tiên là xác định nguồn gốc và đặc tính của mẫu. Trong hầu hết các trường hợp, thông tin này có thể được lấy từ khách hàng. Chọn ít nhất một trong các khả năng sau:

- Nước có nồng độ vi sinh vật tạp dự kiến thấp, ví dụ: nước ăn uống:

- và nồng độ dự kiến của các loài Legionella cao -> mẫu phải được phân tích theo quy trình trong 8.4.2;

- và nồng độ dự kiến của các loài Legionella thấp -> mẫu phải được phân tích bằng một trong các quy trình trong 8.4.3.

- Nước có nồng độ vi sinh vật tạp dự kiến cao, ví dụ: tháp làm mát bay hơi, nước xử lý, nước từ buồng lọc khí, nước từ phòng nha khoa -> mẫu phải được phân tích theo quy trình trong 8.4.4.

- Nước có nồng độ vi sinh vật tạp cao dự kiến hoặc vi sinh vật chỉ được loại bỏ ra khỏi mẫu bằng xử lý nhiệt/axit kết hợp, ví dụ: nước thải, nước mặt -> mẫu phải được phân tích theo quy trình nêu trong 8.4.5.

Bước thứ hai là xác định giới hạn dưới mong muốn của mức phát hiện và chọn một hoặc nhiều phương pháp. Ví dụ về giới hạn dưới của mức phát hiện đối với từng phương pháp được thể hiện trong Bảng J.1. Lưu ý rằng các phương pháp khác nhau có các ưu điểm và các nhược điểm (xem Bảng J.2).

Bước thứ ba là lựa chọn phương pháp xử lý cần thiết. Bên cạnh các biện pháp xử lý bắt buộc, thì có thể thực hiện các biện pháp xử lý tùy chọn.

Bước thứ tư là lựa chọn môi trường nuôi cấy yêu cầu. Bên cạnh môi trường nuôi cấy yêu cầu, có thể sử dụng môi trường nuôi cấy tùy chọn.

Bảng J.1 - Giới hạn dưới của mức phát hiện đối với từng phương pháp

Bảng J.2 - Ưu nhược điểm của các phương pháp khác nhau

Hình J.1 - N tiêu chuẩn này [nền mẫu A; Quy trình 1 Môi trường A và B]

Bảng J.3

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] IS0 13843, Water quality - Requirements for establishing performance characteristics of quantitative microbiological methods

[2] ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

[3] Bopp C.A., et al. Isolation of Legionella spp. from environmental water samples by low-pH treatment and use of a selective medium. J. Clin. Microbiol. April 1981, 13 (4), pp. 714-719

[4] Dennis P.J., et al. Comparison of isolation methods for Legionella spp. Legionella, Proceedings of the 2nd International Symposium. American Society for Microbiology, 1984. pp. 294-296

[5] Ditommaso S., Recovery of Legionella species from water samples using an internal method based on ISO 11731: suggestions for revision and implementation. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2011, 70 pp. 200-206

[6] Smith L. et al., Comparison of membrane filters for recovery of legionellae from water samples. Appl. Environ. Microbiol. January 1993, 59 (1), pp. 344-346

[7] Wadowsky R.M., Yee R.B., Glycine-containing selective medium for isolation of Legionellaceae from environmental specimens. Appl. Environ. Microbiol. November 1981, 42 (5), pp. 768-772.