Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9300:2014 Vi sinh vật-Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn

  • Thuộc tính
  • Nội dung
  • Tiêu chuẩn liên quan
  • Lược đồ
  • Tải về
Mục lục
Tìm từ trong trang
Lưu
Theo dõi hiệu lực VB

Đây là tiện ích dành cho thành viên đăng ký phần mềm.

Quý khách vui lòng Đăng nhập tài khoản LuatVietnam và đăng ký sử dụng Phần mềm tra cứu văn bản.

Báo lỗi
  • Báo lỗi
  • Gửi liên kết tới Email
  • Chia sẻ:
  • Chế độ xem: Sáng | Tối
  • Thay đổi cỡ chữ:
    17
Tình trạng hiệu lực: Đã biết
Hiệu lực: Đã biết
Tình trạng: Đã biết

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9300:2014

VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH TRÊN CÂY TRỒNG CẠN

Microorganisms - Determination of the antagonistic activity to Ralstonia solanacearum Smith causing bacteria wilt disease of upland plant

Lời nói đu

TCVN 9300:2014 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH TRÊN CÂY TRNG CẠN

Microorganisms - Determination of the antagonistic activity to Ralstonia solanacearum Smith causing bacteria wilt disease of upland plant

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc xác định hoạt tính đối kháng của các vi sinh vật đối kháng (được phân lập từ các nguồn khác nhau) với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn.

2. Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau.

2.1. Vi sinh vật đi kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn (antagonistic microorganismsms to Ralstonia solanacearum Smith causing bacteria wilt disease of upland plant)

Các vi sinh vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển hay làm mất hoặc giảm độc tính gây bệnh héo xanh của vi khun Ralstonia solanacearum Smith trên cây trồng cạn.

2.2. Hoạt tính đi kháng của vi sinh vật đi kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn (antagonistic activity microorganismsms to Ralstonia solanacearum Smith causing bacteria wilt disease of upland plant)

Khả năng ca vi sinh vật:

- tạo được vòng đối kháng (vòng trong sut) bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc của vi sinh vật đó khi tiếp xúc với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo và

- làm giảm được tỷ lệ cây trồng bị bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra.

2.3. Cây bị bệnh (desease plant)

Cây có ít nhất một lá cây bị bệnh héo xanh vi khuẩn

3. Môi trường nuôi cấy

Có thể sử dụng các môi trường có bán sẵn trên thị trường hoặc môi trường dưới đây:

3.1. Thành phần môi trường

3.1.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Rastonia solanacearum Smith

Môi trường SP (Sucrose Peptone)

Xem A.1 của Phụ lục A.

3.1.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đối kháng

Trường hợp đã biết rõ loài vi sinh vật đối kháng cần xác định, môi trường được sử dụng để nuôi cấy là môi trường đặc hiệu hoặc môi trường có thành phần thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của loài vi sinh vật đã biết.

Trường hợp chưa biết chính xác vi sinh vật cần xác định thì lựa chọn một trong các môi trường nuôi cấy như sau.

3.1.2.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường Thịt - Pepton

Xem A.2 của Phụ lục A.

3.1.2.2. Môi trường nuôi cấy nấm sợi

- Môi trường Czapeck – Dox

Xem A.3 của Phụ lục A.

- Môi trường PD (Potato Dextrose)

Xem A.4 của Phụ lục A.

3.1.2.3. Môi trường nuôi cy xạ khuẩn

- Môi trường Gauze

Xem A.5 của Phụ lục A.

- Môi trường ISP - 4 (Inorganic Salts Starch - 4)

Xem A.6 của Phụ lục A.

3.2. Cách chuẩn bị

Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho (3.1).

3.2.1. Môi trường dịch th

Phân phi môi trường (3.1) vào bình tam giác (4.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (4.1.2).

3.2.2. Môi trường thạch đĩa

Phân phối môi trường (3.1) vào bình tam giác (4.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (4.1.2), làm nguội đến 50 °C, phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri (4.2.4) đã chuẩn bị sẵn (4.4); tiến hành trong tủ cấy vô trùng (4.1.1).

3.3. Dung dịch pha loãng

Dung dịch pha loãng nước muối sinh lý (NaCI 0,85 %), pH = 7, không chứa các hợp chất nitơ;

Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào các ống nghiệm (4.2.5) hoặc 90 ml dịch pha loãng cho vào các bình tam giác (4.2.1), đậy nút bông và khử trùng 121 °C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (4.1.2).

4. Thiết bị, dụng cụ và vật tư

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ, vật tư thông thường trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và cụ thể như sau:

4.1. Thiết bị

4.1.1. Tủ cấy vô trùng, vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m3/h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1 mm đến 0,3 mm.

4.1.2. Nồi hấp áp lực, giữ được áp suất ổn định ở 101,3 kPa, nhiệt độ 121 °C.

4.1.3. Tủ sấy, nhiệt độ từ 40 °C đến 260 °C.

4.1.4. Tủ m, nhiệt độ từ 20 °C đến 60 °C.

4.1.5. Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ đạt 150 r/min, nhiệt độ từ 20 °C đến 40 °C.

4.1.6. Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg.

4.1.7. Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.

4.1.8. Máy đo pH, từ 0 pH đến 14 pH.

4.1.9. Máy trộn Vortex, tốc độ lắc đạt 1000 r/min.

4.2. Dụng cụ

4.2.1. Bình tam giác, dung tích 250 ml.

4.2.2. Cốc thủy tinh, dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml.

4.2.3. Cốc định lượng, dung tích 100 ml và 500 ml.

4.2.4. Đĩa Petri, đường kính 90 mm.

4.2.5. Ống nghiệm, 18 mm x 180 mm.

4.2.6. Que cấy.

4.2.7. Que gạt mẫu (bàn trang).

4.2.8. Pipet (Micropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml và 1 ml.

4.3. Vật tư

4.3.1. Đất, tơi xốp, có hàm lượng hữu cơ không nhỏ hơn 1,5 % và pH từ 6,0 đến 6,5.

4.3.2. Hạt hoặc củ giống, là hạt hoặc c giống sạch, giống mẫn cảm trung bình với bệnh héo xanh do vi khuẩn Rastonia solanacearum Smith gây ra.

4.3.3. Chậu vại trồng cây, là nhựa trung tính hoặc gốm.

4.4. Chuẩn bị dụng cụ

Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy, nhiễm vi sinh vật và xác định hoạt tính của vi sinh vật phải được khử trùng bằng một trong hai phương pháp sau:

+ Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (4.1.3) hoặc;

+ Khử trùng ướt: Giữ nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hp áp lực (4.1.2).

4.5. Chun bị vật

4.5.1. Đất: Tiệt trùng bằng phương pháp khử trùng ngưng đoạn [khử trùng 3 ngày liên tiếp ở 121 °C, mỗi lần không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (4.1.2)].

4.5.2. Chậu vại: Tiệt trùng bằng cồn 96°.

4.5.3. Hạt ging: Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch H2O2 4 %, thời gian từ 3 min đến 4 min, sau đó rửa sạch từ 2 lần đến 3 lần bằng nước vô trùng.

4.5.4. Chủng vi sinh vật kiểm định: Chủng Rastonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh cây trồng cạn.

5. Tiến hành

5.1. Nuôi cấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh

Lấy một vòng que cấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh (4.5.4) cấy vào môi trường dịch thể SP đã chuẩn bị sẵn (3.2.1). Nuôi cấy lắc trong thời gian 48 h, ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đm bảo mật độ tế bào vi khuẩn không nh hơn 108 CFU/ml.

Dùng pipet vô trùng lấy 10 ml dịch vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh cho vào bình tam giác chứa 90 ml dung dịch pha loãng đã chun bị sẵn (3.3), trộn kỹ bằng máy lắc (4.1.5) hay máy trộn Vortex (4.1.9). Dùng pipet vô trùng tiếp tục lấy 1 ml dung dịch huyền phù cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn b sẵn (3.3), trộn kỹ bằng máy trộn Vortex (4.1.9). Tiếp tục pha loãng để thu được dịch huyền phù có mật độ tế bào vi khuẩn đạt 106CFU/ml.

Tiến hành trong tủ cy vô trùng (4.1.1).

5.2. Nuôi cấy vi sinh vật đối kháng

Lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào bình tam giác chứa môi trường dịch thể thích hợp đã chuẩn b sẵn (3.2.1).

Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp (từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 °C đến 37 °C không ít hơn 5 ngày đối với xạ khun); đảm bảo mật độ tế bào vi khuẩn không nhỏ hơn 108 CFU/ml.

5.3. Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng

5.3.1. Xác định hoạt tính đi kháng của vi sinh vật đối kháng thông qua kích thước vòng đối kháng

5.3.1.1. Cấy mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh (5.1) cấy vào đĩa Petri chứa môi trường SP đã chun bị sẵn (3.2.2). Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch huyền phù vi khun thm đều trên bề mặt thạch. Đợi từ 20 min đến 30 min cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 1 cm đục lỗ thạch ở phần tâm của đĩa Petri. Dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn loại bỏ phần thạch vừa đục.

Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch vi sinh vật đối kháng (5.2) đưa vào các giếng đã được loại bỏ thỏi thạch, giữ điều kiện thích hợp tùy thuộc từng chng ging vi sinh vật đối kháng (từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 2 ngày đi với vi khuẩn, từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 °C đến 37 °C không ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn).

Mỗi mẫu được cấy lặp lại không ít hơn 3 lần. Tiến hành trong tủ cấy vô trùng (4.1.1).

CHÚ THÍCH:

1) Không để dịch vi khuẩn dính vào thành đĩa Petri

2) Cần giữ cho các đĩa Petri trên mặt phẳng để tránh dịch vi sinh vật đối kháng tràn trên bề mặt đĩa thạch.

5.3.1.2. Tính kết quả

Hoạt tính đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh của vi sinh vật thể hiện thông qua kích thước vòng đối kháng (vòng trong suốt bao quanh giếng chứa dịch vi sinh vật đối kháng).

Kích thước vòng đi kháng (mm) của vi sinh vật được tính theo công thức (1):

Kích thước vòng đối kháng (mm) = D - d           (1)

trong đó:

D là đường kính vòng đối kháng, tính bằng milimet (mm);

d là đường kính lỗ giếng, tính bằng milimet (mm).

Kết quả là giá trị trung bình cộng của các lần lặp lại.

5.3.2. Xác định hoạt tính đối kháng của vi sinh vật thông qua tỷ lệ cây trồng bị bệnh

5.3.2.1. B trí thử nghiệm

Thử nghiệm được tiến hành trong chậu vại (4.5.2) với 2 công thức:

Công thức đi chứng: Nhiễm vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh

Công thức thí nghiệm: Nhiễm vi sinh vật đối kháng và vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh.

Mỗi công thức được lặp lại không ít hơn 3 lần với tổng số cây không ít hơn 50 cây.

5.3.2.2. Tiến hành thử nghiệm

Bước tiến hành

Công thức đối chứng

Công thức thí nghiệm

Bước 1

Nhiễm môi trường dịch thể đã chun bị sẵn (3.2.1) 30 min trước khi gieo (trồng), lượng tương đương với lượng nhiễm vi sinh vật đi kháng (5.2) công thức thí nghiệm.

Nhiễm dịch vi sinh vật đối kháng (5.2) vào đất đã được khử trùng (4.5.1) 30 min trước khi gieo (trồng); đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 106 CFU/g đất.

Bước 2

Ngâm hạt hoặc củ giống (4.5.3) trong dịch vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh (5.1) có mật độ tế bào không nhỏ hơn 108 CFU/ml trong thời gian 30 min.

Ngâm hạt hoặc củ giống (4.5.3) trong dịch vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh (5.1) có mật độ tế bào không nhỏ hơn 108 CFU/ml trong thời gian 30 min.

Bước 3

Gieo/trng hạt/củ đã nhiễm vi khun Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh vào đất đã chuẩn bị.

Gieo/trng hạt/củ đã nhiễm vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh vào đất đã chun bị.

Thí nghiệm được chăm sóc theo qui trình phù hợp với từng đối tượng cây chủ; đảm bảo sự phát sinh, phát triển của vi khun Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh, độ ẩm tương đối (RH) không nhỏ hơn 70 % (sử dụng nước vô trùng để giữ ẩm độ) và nhiệt độ đạt từ 25 °C đến 30°C;

Quan sát và theo dõi triệu chứng héo của cây sau 5 ngày đến 21 ngày gieo trồng, ghi lại những đánh giá về tình trạng mắc bệnh héo xanh của cây trồng (có hoặc không có triệu chứng mắc bệnh).

CHÚ THÍCH: Thử nghiệm phi bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưng của các yếu tố phi thí nghiệm.

5.3.2.3. Tính kết quả

Tỷ lệ cây bị bệnh (%) được tính theo công thức (2):

Tỷ lệ cây bị bệnh (%) =

Số cây bị bệnh

x 100

(2)

Số cây điều tra

So sánh tỷ lệ cây bị bệnh giữa công thức thí nghiệm vi công thức đối chứng và đánh giá hoạt tính đi kháng của vi sinh vật theo các cấp độ nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 - Mức độ hoạt tính đối kháng ca vi sinh vật

Tỷ lệ cây bị bệnh (%)

Cấp độ đi kháng

Mức độ hoạt tính đi kháng

Không lớn hơn 30

1

Cao

Từ 31 đến 50

2

Khá

Từ 51 đến 70

3

Trung bình

Từ 71 đến 80

4

Yếu

Không nhỏ hơn 81

5

Không có

6. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm cần bao gồm đầy đủ các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đ về mẫu thử;

- phương pháp ly mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- tất cả các thao tác không qui định trong tiêu chun này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưng đến kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được;

- nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Qui định)

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

A.1. Môi trường SP (Sucrose - Peptone)

Sacaroza (C12H22O11)

20,0 g

Pepton

5,0 g

Dikali hydro phosphat (K2HPO4)

0,5 g

Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O)

0,25 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,8 đến 7,0

CHÚ THÍCH: Nếu môi trường thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch.

A.2. Môi trường Thịt Pepton

Chất chiết thịt bò

5,0 g

Pepton

10,0 g

Natri clorua (NaCl)

5,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,8 đến 7,0

A.3. Môi trường Czapek - Dox

Sacaroza (C12H22O11)

30,0 g

Natri nitrat (NaNO3)

2,0 g

Kali clorua (KCI)

1,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,0 g

Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O)

0,5 g

Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeSO4.7H2O)

0,01 g

Nước cất vừa đ

1000 ml

pH

6,0 đến 6,5

CHÚ THÍCH:

1) pH môi của trường được điều chỉnh bằng axit axetic 1N

2) Nếu môi trường thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch.

A.4. Môi trường PD (Potato Dextrose)

Dextrose (C6H12O6)

20,0 g

Khoai tây*

200,0 g

Thạch

20,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

6,0 đến 6,5

CHÚ THÍCH:

1) Khoai tây thái nhỏ, cho vào 1 lít nước và đun sôi trong 20 min; sau đó lọc lấy nước trong để sử dụng làm môi trường;

2) pH môi ca trường được điều chỉnh bằng axit axetic 1N;

3) Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch.

A.5. Môi trường Gauze

Tinh bột tan (C6H10O5)n)

20,0 g

Kali nitrat (KNO3)

1,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

0,5 g

Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O)

0,5 g

Natri clorua (NaCI)

0,5 g

Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeSO4.7H2O)

0,01 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

7,0 đến 7,2

CHÚ THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch.

A.6. Môi trường ISP- 4 (Inorganic Salts Starch - 4)

Tinh bột tan (C6H10O5)n)

10,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,0 g

Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O)

1,0 g

Natri clorua (NaCI)

1,0 g

Amoni sulphat (NH4)2SO4

2,0 g

Canxi cacbonat (CaCO3)

1,0 g

Nước cất vừa đủ

1000 ml

pH

7,0 đến 7,2

CHÚ THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] 10 TCN 714:2006. Vi sinh vật - Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây trồng cạn Ralstonia solanacearum Smith.

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 9300:2014

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9300:2014 Vi sinh vật-Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh trên cây trồng cạn
Số hiệu:TCVN 9300:2014Loại văn bản:Tiêu chuẩn Việt Nam
Cơ quan ban hành: Bộ Khoa học và Công nghệLĩnh vực:Nông nghiệp-Lâm nghiệp
Năm ban hành:2014Hiệu lực:
Người ký:Tình trạng hiệu lực:
Đã biết

Vui lòng đăng nhập tài khoản gói Tiêu chuẩn hoặc Nâng cao để xem Tình trạng hiệu lực. Nếu chưa có tài khoản Quý khách đăng ký tại đây!

Vui lòng Đăng nhập tài khoản gói Tiêu chuẩn hoặc Nâng cao để xem VB liên quan.

Chưa có tài khoản? Đăng ký tại đây

Vui lòng đăng nhập tài khoản gói Tiêu chuẩn hoặc Nâng cao để xem Lược đồ.
Nếu chưa có tài khoản Quý khách đăng ký tại đây!
* Lưu ý: Để đọc được văn bản tải trên Luatvietnam.vn, bạn cần cài phần mềm đọc file DOC, DOCX và phần mềm đọc file PDF.

Để được giải đáp thắc mắc, vui lòng gọi

19006192

Theo dõi LuatVietnam trên YouTube

TẠI ĐÂY

Vui lòng đợi