Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-41:2019 Quy trình chuẩn đoán bệnh dịch tả lợn châu Phi

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-41:2019

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN -  PHẦN 41: BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI

Animal disease - Diagnostic procedure Part 41: African Swine Fever

Lời nói đầu

TCVN 8400-41: 2019 do Chi cục Thú ý vùng VI - Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần:

- TCVN 8400-1: 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2: 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3: 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4: 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

- TCVN 8400-5: 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6: 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7: 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8: 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9: 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ l;

- TCVN 8400-10: 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11: 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12: 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13: 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14: 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15: 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16: 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17: 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18: 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19: 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20: 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21: 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22: 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23: 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24: 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25: 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26: 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27: 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28: 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29: 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30: 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31: 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32: 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33: 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34: 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35: 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36: 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37: 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38: 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus;

- TCVN 8400-39: 2016, phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40: 2016, phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra.

- TCVN 8400-41: 2019, phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi.

- TCVN 8400-42: 2019, phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43: 2019, phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44: 2019, phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45: 2019, phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46: 2019, phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47: 2019, phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển.

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 41: BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 41: African Swine Fever

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn Châu Phi do vi rút Asfivirus gây ra.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8402:2010 Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever)

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever - ASF) là bệnh truyền nhiễm gây sốt cao, xuất huyết với tỷ lệ ốm có thể lên đến 100 %. ASF do một loại vi rút gây ra, tên gọi ASFV. ASFV là vi rút ADN thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus. Thời gian ủ bệnh trong tự nhiên thường 4 ngày đến 19 ngày. Các chủng vi rút độc lực cao gây xuất huyết bán cấp tính và cấp tính với các đặc điểm sốt cao, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4 ngày đến 10 ngày, đôi khi chết ngay cả trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên. Các chủng độc lực thấp hơn có triệu chứng lâm sàng không điển hình như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mỏi - dễ bị nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh lý khác ở lợn.

3.2  Từ viết tắt

- ASFV (African Swine Fever Virus): Vi rút dịch tả lợn Châu Phi;

- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp;

- Realtime PCR (Realtime Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực;

- ELISA (Enzyme - linked immunosorbent assay): Phản ứng miễn dịch liên kết enzyme;

- EDTA (Ethylene Diamin Tetraacetic acid): chất chống đông;

- IFA (Indirect fluorescent antibody): Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp;

- FAT (Fluorescent antibody test): Phản ứng miễn dịch huỳnh quang;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

- Ct (Cycle threshold): Chu kỳ ngưỡng;

- FITC (Fluorescein isothiocyanate): Thuốc nhuộm phát huỳnh quang;

- ARN: Axít ribonucleic;

- ADN: Axít deoxyribonucleic;

- DNAse (Deoxyribonuclease): Enzyme thủy phân liên kết của phân tử ADN;

- RNAse (Ribonuclease): Enzyme thủy phân liên kết của phân tử ARN;

- TBE 10X (Tris-axit boric- Ethylendiamin Tetraacetic axit): Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần.

4  Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAse và DNAse, trừ khi có quy định khác.

4.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

4.1.1  Ống nghiệm sạch, vô trung và có chất chống đông EDTA;

4.1.2  Cồn (Ethanol), từ 70 % đến 100 %;

4.1.3  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);

4.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR

4.2.1  Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

4.2.2  Kít nhân gen realtime PCR;

4.2.3  Mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò, thực hiện phản ứng realtime PCR;

4.2.4  Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận dương tính hoặc ADN chuẩn dương tính tách chiết từ ASFV có giá trị Ct đã biết trước;

4.2.5  Nước tinh khiết, không có DNAse/RNAse;

4.2.6  Bột agarose;

4.2.7  Dung dịch TBE 10X;

4.2.8  Chất nhuộm gel (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

4.2.9  Thang chuẩn ADN (100 bp);

4.2.10  Mồi xuôi, mồi ngược, thực hiện phản ứng PCR.

4.3  Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA

4.3.1  Kít ELISA, sử dụng kít thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể ASFV, khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất;

4.3.2  Nước cất khử khoáng.

4.4  Nguyên liệu và thuốc thử dùng cho phản ứng miễn dịch huỳnh quang/ miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

4.4.1  Dung dịch aceton (30% aceton + 70% methanol), dùng cố định mô;

4.4.2  Thuốc nhuộm fluorescein isothiocyanate (FITC);

4.4.3  Mẫu mô và huyết thanh đối chứng dương chuẩn;

4.4.4  Tế bào thận lợn hoặc thận khỉ (5 x 10⁵ tế bào/ml).

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

5.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

5.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

5.1.3  Máy lắc trộn, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

5.1.4  Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, panh, kéo, vô trùng;

5.1.5  Xy lanh và kim tiêm loại 18G;

5.1.6  Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

5.2  Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp realtime PCR

5.2.1  Máy realtime PCR, PCR, máy nhân gen;

5.2.2  Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

5.2.3  Máy lắc ủ nhiệt;

5.2.4  Máy spindown, máy ly tâm lắng;

5.2.5  Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có).

5.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

5.3.1  Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng từ 450 nm đến 650 nm;

5.3.2  Thiết bị ủ mẫu, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C.

5.4  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

5.4.1  Kính hiển vi huỳnh quang;

5.4.2  Máy cắt mô lạnh;

5.4.3  Lam kính/lamen.

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Dịch tễ học

Lợn nhà là loài động vật bị nhiễm tự nhiên bởi vi rút ASFV. Lợn rừng Châu Âu bị nhiễm ASFV với triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ chết cao. Bệnh dịch tả lợn Châu Phi lưu hành ở Châu Phi bởi vòng truyền lây giữa các loài lợn hoang dã và ve mềm. Một số loài ve mềm Orithodoros moubata ở Châu Phi và O. erraticus ở bán đảo Iberia là nguồn chứa và vector sinh học ASFV.

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi thường lây lan giữa lợn nhà thông qua tiếp xúc đường miệng hoặc mũi, hoặc các vết cắn. Động vật hết bệnh sau khi nhiễm bệnh cấp tính và mạn tính có thể bị nhiễm bệnh trở lại, và trở thành vật mang ASFV. Bệnh có thể xảy ra quanh năm. Lợn nhà ở mọi lứa tuổi đều dễ dàng mắc bệnh.

ASFV đề kháng mạnh với môi trường đặc biệt là nhiệt độ và pH. ASFV phân lập từ huyết thanh và máu lưu trữ nhiệt độ phòng trong vòng 18 tháng. Tuy nhiên, ASFV bị bất hoạt khi xử lý ở 60 °C trong 30 phút, vi rút cũng được bất hoạt bởi các thuốc khử trùng thương mại. Trong các sản phẩm thịt đông lạnh hoặc chưa nấu chín ASFV có thể tồn tại trong vài tuần hoặc cả tháng, không tìm thấy ASFV ở thịt lợn đã nấu hoặc đóng hộp được xử lý nhiệt ở 70 °C.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

Thời gian vi rút dịch tả lợn Châu Phi ủ bệnh trong tự nhiên thường từ 4 đến 19 ngày. Các chủng vi rút độc lực cao gây xuất huyết ở thể bán cấp tính và cấp tính với các đặc điểm sốt cao 40 °C đến 41 °C, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4 đến 10 ngày, đôi khi chết trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên. Tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100 %. Các dòng vi rút độc lực thấp có triệu chứng lâm sàng không điển hình như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mỏi - dễ bị nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh lý khác ở lợn và có thể không nghi ngờ đến ASFV. Lợn bị nhiễm các dòng vi rút độc lực thấp không bị xuất huyết và hình thành kháng thể, nhưng cũng có thể tìm thấy bệnh tích rời rạc trên phổi hoặc trên da ở những vùng xương nhô ra và các vùng bị chấn thương ở một vài con.

Thể bán cấp tính và mạn tính thường gặp hơn thể cấp tính. Thể bán cấp tính được đặc trưng bởi giảm tiểu cầu, bạch cầu và xuất huyết. Thể mạn tính được đặc trưng bởi hô hấp thay đổi, sảy thai và tỷ lệ tử vong thấp.

6.3  Bệnh tích

Có nhiều bệnh tích khác nhau được quan sát tùy thuộc vào chủng độc lực của vi rút. Bệnh tích đặc trưng của thể cấp tính và bán cấp tính là xuất huyết lan rộng và mô lympho bị phá hủy. Ngược lại, thể mạn tính bệnh tích ít hoặc không xuất hiện.

Thể cấp tính: Bệnh tích đại thể chính được quan sát ở lách, hạch lympho, thận và tim. Lá lách có thể bị sậm màu, sưng to, nhồi huyết. Các hạch lympho xuất huyết, phù. Thận xuất huyết kim châm ở vỏ thận. Xuất hiện dịch trong các xoang, xuất huyết đốm trên niêm mạc bàng quang, phổi. Trong một số trường hợp thấy xuất huyết ở màng ngoài tim.

Thể bán cấp tính: được đặc trưng bởi xuất huyết mảng rộng trên hạch lympho và thận, lách sưng to và xuất huyết, phổi sung huyết và phù nề, viêm phổi kẽ.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

7.1.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo hướng dẫn của quy trình mổ khám theo TCVN 8402:2010.

Mẫu bệnh phẩm: máu chống đông, lách, hạch bạch huyết, hạch amydal, thận, dịch tiết, dịch nổi tế bào sau khi phân lập vi rút để phát hiện vi rút. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh để phát hiện kháng thể ASFV.

CHÚ THÍCH: Đối với máu chống đông dùng kim tiêm vô trùng 18G (5.1.5) lấy khoảng 5 ml máu của động vật đang sốt nghi mắc bệnh cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA (4.1.1), lắc nhẹ.

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện từ 2°C đến 8°C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng từ âm 20°C đến âm 80°C. Huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C tối đa 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 20°C (đối với mẫu huyết thanh) và ở âm 80°C (đối với mẫu bệnh phẩm khác).

7.1.2  Xử lý mẫu bệnh phẩm

Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm (lách, hạch amydal, hạch bạch huyết, thận của lợn) nghiền (5.1.4) trong dung dịch PBS (4.1.3) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS (4.1.3)). Sau đó ly tâm huyễn dịch 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (5.2.2). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện ASFV bằng phương pháp realtime PCR, PCR hoặc phân lập vi rút.

7.2  Phát hiện kháng nguyên

7.2.1  Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (FAT)

- Chuẩn bị mẫu: Dùng máy cắt mô lạnh (5.4.2) cắt các mô bệnh phẩm (lách, hạch, thận) thành những lát mỏng từ 2 μm đến 5 μm hoặc phết cặn tế bào từ môi trường ủ bạch cầu lên lam kính (5.4.3), để khô tự nhiên và cố định bằng acetone trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

- Nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) kết hợp với globulin miễn dịch kháng ASFV với nồng độ khuyến cáo hoặc đã được chuẩn độ trước với thời gian 1 giờ ở nhiệt độ 37 °C.

- Cố định và nhuộm tương tự như trên với mẫu mô đối chứng âm, đối chứng dương.

- Rửa sạch bằng cách ngâm 4 lần trong PBS (phụ lục A.1), dán mô đã nhuộm trong dung dịch đệm glycerin (phụ lục A.2), sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng thích hợp (5.4.1).

- Đọc kết quả:

+ Dùng kính hiển vi huỳnh quang (5.4.1) lần lượt đọc các mẫu đối chứng trước, các mẫu bệnh phẩm sau.

+ Mô dương tính nếu có các hạt huỳnh quang phát sáng trong tế bào chất.

+ Mô âm tính nếu không có các hạt huỳnh quang phát sáng trong tế bào chất.

7.2.2  Phương pháp PCR và realtime PCR

7.2.2.1  Tách chiết ADN

- Tiến hành chiết tách ADN từ các mẫu đã được xử lý (7.1.2), ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96¹⁾, hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ADN vi rút dịch tả lợn Châu Phi (tham khảo Phụ lục B).

- Mẫu ADN vi rút sau khi chiết tách được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

7.2.2.2  Phương pháp PCR

- Chuẩn bị mồi cho phản ứng PCR: Trình tự và nồng độ mồi phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi (tham khảo Bảng C.1, Phụ lục C).

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn mồi phù hợp.

- Sử dụng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Hot Start Taq Gold DNA polymerase²⁾ với nồng độ và thể tích tham khảo Bảng C.2, Phụ lục C.

- Tiến hành phản ứng PCR (tham khảo Phụ lục C).

7.2.2.3  Phương pháp realtime PCR

- Sử dụng cặp mồi xuôi, mồi ngược và đoạn dò (tham khảo Bảng D.1, Phụ lục D) với nồng độ thích hợp (mồi ở nồng độ 20 μM, đoạn dò ở nồng độ 5 μM) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp phản ứng (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix- UDG ³⁾, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi và đoạn dò cần tham khảo khuyến cáo của OIE cập nhật mới để lựa chọn phù hợp.

- Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho 1 phản ứng (tham khảo Bảng D.2, Phụ lục D).

- Sau khi chuẩn bị xong nguyên liệu Master mix tiến hành:

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 μl ADN dương chuẩn của vi rút ASF có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.

+ Cho 5 μl nước tinh khiết, không có nuclease vào ống PCR đối chứng âm

+ Cho 5 μl ADN của mẫu vừa chiết tách vào ống PCR + Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (5.2.1).

CHÚ THÍCH:

1) Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

2) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị.

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng tham khảo Bảng D.3, Phụ lục D.

- Kết quả của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

- Đánh giá kết quả:

+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40

+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct

+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.

- Đánh giá kết quả: Mẫu có vi rút gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi khi kết quả realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

7.3  Phát hiện kháng thể

7.3.1  Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể ASFV bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ví dụ sử dụng kít Ingezim PPA compac (11.PPA.K3) của hãng INGENASA, các bước thực hiện tham khảo phụ lục E.

7.3.2  Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)

- Chuẩn bị huyễn dịch tế bào thận lợn hoặc khỉ đã nhiễm vi rút ASF ở nồng độ 5 x 10⁵ tế bào/ ml, dàn những giọt nhỏ huyễn dịch trên lam kính, để khô tự nhiên và cố định với dung dịch acetone (4.4.1.) tại nhiệt độ phòng trong 10 phút. Chú ý các lam kính được cất giữ ở âm 20 °C cho đến khi tiến hành.

- Bất hoạt huyết thanh ở 56 °C trong 30 phút.

- Thêm huyết thanh kiểm tra, huyết thanh đối chứng dương, huyết thanh đối chứng âm trên lam kính có phết tế bào đã nhiễm vi rút và tế bào chưa nhiễm vi rút, sau đó ủ ở nhiệt độ 37 °C trong 60 phút.

- Rửa sạch lam kính bằng cách ngâm 4 lần trong PBS (xem phụ lục A) và sau đó với nước cất.

- Thêm thuốc nhuộm FITC gắn protein A ở nồng độ khuyến cáo hoặc đã được chuẩn độ trước vào tất cả các lam kính, sau đó ủ ở nhiệt độ 37 °C trong 60 phút.

- Rửa sạch lam kính bằng cách ngâm 4 lần trong PBS (xem phụ lục A) và sau đó với nước cất, dán mô đã nhuộm trong dung dịch đệm glycerin (xem phụ lục A), sau đó kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng thích hợp (5.4.1).

- Đọc kết quả: đối chứng huyết thanh dương tính trên tế bào nhiễm vi rút phải dương tính và đối chứng còn lại phải âm tính. Huyết thanh dương tính nếu môi trường nhiễm có huỳnh quang đặc hiệu.

8  Kết luận

Lợn được xác định mắc bệnh dịch tả lợn Châu Phi khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh dịch tả lợn Châu Phi và phải có kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

- Phương pháp PCR, realtime PCR phát hiện vi rút dương tính

- Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (FAT) phát hiện vi rút dương tính

- Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) phát hiện kháng thể dương tính ở lợn chưa tiêm phòng

- Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể dương tính ở lợn chưa tiêm phòng.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS).

Thành phần

Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHi CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch đệm glycerin pH ~ 8,3

Cách chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, dùng khi đọc huỳnh quang.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

- Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

- Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

- Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 μl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

- Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

- Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

- Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

- Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít.

- Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

- Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 pl dung dịch hạt từ.

- Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

- Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 μl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

- Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phương pháp PCR phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi

C.1  Trình tự mồi

Bảng C.1 - Trình tự mồi xuôi và mồi ngược

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt phản ứng PCR

C.2  Chạy điện di

- Chuẩn bị thạch Agarose (4.2.6) 2 % pha trong dung dịch TBE (4.2.7) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (4.2.8) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

- Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

- Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (loading dye)).

- Sử dụng thang chuẩn ADN (100 bp) (4.2.9).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V- 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

- Đọc kết quả:

+ Mẩu dương tính: Xuất hiện vạch và có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương 257 bp.

+ Mẫu âm tính: Không có vạch.

- Đánh giá kết quả: có vi rút dịch tả lợn Châu Phi trong mẫu bệnh phẩm nếu kết quả PCR dương tính. Nếu kết quả nghi ngờ cần lấy sản phẩm PCR giải trình tự gen.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp realtime PCR phát hiện vi rút Dịch tả lợn Châu Phi

Bảng D.1 -Trình tự mồi và đoạn dò

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime PCR

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể ASFV

Sử dụng kít thương mại Ingezim PPA compac 11.PPA.K3

E.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Tất cả các nguyên liệu (ngoại trừ Conjugate) để 30 phút ở nhiệt độ phòng (20 °C đến 25 °C) trước khi tiến hành phản ứng.

- Pha loãng dung dịch nước rửa 40 X: 40 ml dung dịch nước rửa đậm đặc với 960 ml nước khử ion.

E.2  Cách tiến hành

1. Nhỏ 50 μl Dilution Buffer vào các giếng:

Nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng dương vào 2 giếng (ví dụ: A1 và B1)

Nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng âm vào 2 giếng (ví dụ: A2 và B2)

Nhỏ 50 μl huyết thanh cần kiểm tra vào các giếng còn lại.

2. Dán đĩa lại và ủ ở nhiệt độ 36 °C (± 1 °C) trong 1 giờ ± 5 phút hoặc qua đêm (từ 16 giờ đến 20 giờ) ở nhiệt độ phòng từ 20 °C đến 25 °C.

3. Đổ bỏ dung dịch trong đĩa vào bình chất thải chứa dung dịch NaOH; rửa đĩa bằng cách thêm 300 μl dung dịch nước rửa đã pha ở 1 vào các giếng, rồi đổ bỏ. Lặp lại 4 lần.

4. Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng conjugate 100 X (ví dụ: 110 μl conjugate vào 11 ml Dilution), lắc nhẹ trước khi dùng.

5. Nhỏ 100 μl dung dịch Conjugate 1 X vào tất cả các giếng.

6. Dán đĩa và ủ ở nhiệt độ 36 °C (± 1 °C) trong 30 phút.

7. Rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa như bước 3.

8. Nhỏ 100 μl dung dịch Subtrate vào các giếng. Đặt đĩa ở nhiệt độ phòng từ 20 °C đến 25 °C trong vòng 15 phút.

9. Thêm 100 μl dung dịch stop Solution vào các giếng để dừng phản ứng.

10. Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (mục 5.3.1) ở bước sóng 450 nm trong vòng 5 phút sau khi dừng phản ứng.

E3.  Đọc kết quả

- Điều kiện phản ứng được công nhận khi: NC/PC ≥ 4, trong đó:

NC: Mật độ quang học (OD) trung bình của đối chứng âm

PC: Mật độ quang học (OD) trung bình của đối chứng dương

- Đánh giá kết quả dựa trên X % của mẫu theo công thức sau:

X% = [(NC - Sample OD)/ (NC-PC)] x 100 %

+ Mẫu dương tính khi: X % ≥ 50 %

+ Mau âm tính khi: X % ≤ 40 %

+ Mẫu có giá trị 40 % < X % < 50 % được cho là nghi ngờ

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties), 2012. African swine fever. Chapter 2.8.1. Terrestrial Manual.

[2] AAHL (Australian Animal Health Laboratory) Regional Programme, 2011. African Swine Fever TaqMan Assay. Nucleic Acid Detection for Disease Diagnosis and Emergency Disease Investigation.

[3] Chi Cục Thú Y Vùng VI, 2017. Quy trình phát hiện vi rút dịch tả lợn Châu Phi bằng kỹ thuật realtime PCR.