TIÊU CHUẨN NGÀNH

10TCN 591:2004

NGŨ CỐC VÀ ĐẬU ĐỖ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

Cereals and Pulses - Determination of Tryptophan Content by Spectrophotometric method

Ban hành kèm theo Quyết định số:   05/2004/QĐ-BNN ngày 16 tháng  03 năm 2004

1. Phạm vi áp dụng.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp quang phổ xác định hàm lượng tryptophan trong các loại  ngũ cốc và đậu đỗ.

2. Tiêu chuẩn trích dẫn.

- TCVN 5451-91 ( ISO 950:1979). Ngũ cốc. Lấy mẫu dạng hạt.

- TCVN 4295 - 86. Đậu hạt. Phương pháp thử.

3. Nguyên tắc.

Nguyên tắc của phương pháp là phá vỡ các liên kết peptit của protein bằng cách đun nóng trong dung dịch kiềm bari hydroxit, sau đó nhuộm màu vòng indo tự do của tryptophan bằng thuốc thử paradimetylamino benzandehyt. Trong môi trường axit mạnh khi có mặt của natri nitrit, tryptophan sẽ phản ứng với thuốc thử tạo hợp chất có màu xanh da trời, cường độ màu được đo trên  quang phổ kế ở bước sóng 650nm.

4. Thuốc thử và hoá chất.

Chỉ sử dụng những thuốc thử được công nhận ở cấp phân tích và nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước khử ion hay nước có độ tinh khiết tương đương.

4.1. Tryptophan.

4.2. Bari hydroxit octa hydrat (Ba(OH)₂.8H₂O). Thuốc thử này cần phải được bảo quản tốt, tránh sự tiếp xúc của Ba(OH)₂.8H₂O với không khí tạo ra BaCO₃ gây cản trở trong quá trình định lượng. Trước khi phân tích Ba(OH)₂.8H₂O được tán nhỏ trong cối sứ và dùng ngay.

4.3. Axit clohydric đậm đặc(HCl), d = 1,19g/ml 

4.4. Etanol  96%.

4.5. Paradimetylaminobenzandehyt (DMAB), dung dịch 0,5%. Cân 5,0 gam (chính xác đến 0,1 g) DMAB, hoà tan bằng axit clohydric đậm đặc và định mức đến 1lít.

Dung dịch được bảo quản trong lọ nâu có nút nhám. Thời hạn bảo quản trong một tháng.

Chú ý: Nếu DMAB không tinh khiết, có thể tinh chế lại bằng cách hoà tan 70 gam DMAB trong 100ml etanol 96⁰ nóng. Làm lạnh bằng nước đá, lọc, làm khô lớp tinh thể thu được trên giấy lọc ở nhiệt độ phòng. Bảo quản tinh thể đã làm khô trong lọ thuỷ tinh nâu, có nút nhám.

4.6 Dung dịch axit clohydric 6 mol/l: Thêm nước cất vào 500ml axit clohydric đặc, định mức đến 1 lít.

4.7 Natri nitrit, dung dịch 0,2%. Cân 0,2gam (chính xác đến 0,01gam) natri nitrit  cho vào bình định mức 100ml, hoà tan bằng nước cất và định mức đến vạch, lắc đều. Dung dịch được chuẩn bị ngay trong ngày phân tích.

4.8. Dung dịch chuẩn tryptophan: 0,1mg/ml. Cân 10mg (chính xác đến 0,1mg) tryptophan, hoà tan bằng nước cất vào bình định mức 100ml. Định mức đến vạch bằng nước cất và lắc đều 1ml dung dịch này chứa 0,1 mg tryptophan. Dung dịch chuẩn tryptophan phải được bảo vệ tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời nếu chưa dùng ngay.

5. Thiết bị và dụng cụ.

5.1 Cân phân tích có độ chính xác đến  0,0001g.

5.2 Cân kỹ thuật có độ chính xác đến 0,01g.

5.3 Máy nghiền phòng thí nghiệm

5.4 Sàng có đường kính lỗ sàng 0,5 mm.

5.5 Tủ sấy điện có thể duy trì ở nhiệt độ 110⁰ ± 2⁰C

5.6 Quang phổ kế thích hợp cho việc đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 650nm

5.7 Máy khuấy Voxter hay máy khuấy từ.

5.8 Tủ lạnh

5.9 Máy ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút.

5.10 Bình định mức dung tích 50, 100, 1000 ml.

5.11 Pipet chia độ dung tích 1, 2, 5, 10 ml.

5.12 ống nghiệm chịu nhiệt 16x150mm, có nút xoáy

5.13 Giá  ống nghiệm bằng kim loại.

5.14 ống nghiệm để lên màu, dung tích 15ml.

5.15 Phễu thuỷ tinh đường kính 3-5cm.

5.16 Giấy lọc.

5.17 Cối chày sứ.

6. Lấy mẫu.

Lấy mẫu thí nghiệm từ nguyên liệu mẫu theo TCVN 5451-91 và TCVN 4295- 86.

7. Cách tiến hành.

7.1. Chuẩn bị mẫu thử.

Từ mẫu thử lấy theo mục 6, chia đều và lấy khoảng 100 gam mẫu đem nghiền đến khi lọt hoàn toàn  qua sàng có đường kính lỗ sàng 0,5mm. Các mẫu có độ ẩm cao phải được sấy ở nhiệt độ 50⁰ C trước khi nghiền.  Các chất có hàm lượng chất béo lớn phải được chiết bớt bằng etepetrol trước khi đem nghiền. Trong trường hợp này các kết quả phân tích sẽ được tính theo khối lượng mẫu ban đầu như chưa loại chất béo.

7.2. Tiến hành thử.

7.2.1 Thuỷ phân mẫu.

Từ các mẫu thử đã đựơc nghiền nhỏ (7.1) cân khoảng 100-500mg mẫu chính xác đến 0.1mg cho vào các ống nghiệm chịu nhiệt (5.12) sao cho hàm lượng nitơ trong mẫu đạt khoảng 10mg. Thêm tiếp vào mỗi ống 4g Ba(OH)₂.8H₂O mới tán nhỏ trong cối sứ và 5ml nước cất, có 2 ống nghiệm chỉ có Ba(OH)₂ làm mẫu trắng. Trộn đều dung dịch bằng máy khuấy Voxter hay máy khuấy từ. Rửa thành bình bằng 2ml nước cất. Đậy kín bình bằng các nút xoáy. Dùng giá ống nghiệm (5.13), đặt đứng các ống nghiệm trong tủ sấy đã đạt nhiệt độ 110 ⁰C ± 2  trong 20 giờ (để qua đêm).

Trong mỗi lần phân tích, cứ 10-20 mẫu thì cần có một mẫu kiểm tra với hàm lượng tryptophan đã biết trước.

Sau quá trình thuỷ phân, lắc đều các ống nghiệm, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đặt ống nghiệm vào ngăn đá của tủ lạnh trong 20-30 phút. Trung hoà nhanh dịch thuỷ phân bằng cách thêm vào ống nghiệm 4ml dung dịch axit clohydric 6 mol/l đã được làm lạnh sẵn từ trước trong ngăn đá tủ lạnh.

Chú ý: Dịch thuỷ phân phải được bảo quản tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời nếu chưa phân tích ngay.

7.2.2 Phát triển màu và đo độ hấp thụ quang học.

Chuyển toàn bộ hỗn hợp trong ống nghiệm vào bình định mức 50 ml bằng nước cất, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ và để yên trong 10 phút. Dùng pipet chuyển cẩn thận 2,0 ml dịch đã lắng trong cho vào ống nghiệm lên màu, thêm vào mỗi ống nghiệm 5,0 ml dung dịch DMAB, lắc kỹ và để yên 25phút. Sau đó thêm tiếp 0,2 ml dung dịch natri nitrit, lắc kỹ, ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút hoặc đem lọc. Để yên dịch lọc trong 10 phút, tiến hành đo độ hấp thụ quang học  trên quang phổ kế ở bước sóng 650nm với cuvet 10mm.

7.2.3 Xây dựng đồ thị chuẩn.

Dùng pipet (5.11) lần lượt cho dung dịch chuẩn tryptophan (4.8) vào các bình định mức dung tích 50 ml với lượng dung dịch theo bảng 1. Thêm nước cất đến vạch mức. Lắc kỹ.

Bảng 1

Từ các dung dịch trên, dùng pipet hút lần lượt 2,0 ml cho vào ống nghiệm lên màu, thêm 5,0 ml dung dịch DMAB vào mỗi ống nghiệm, lắc đều, để yên 25 phút. Sau đó thêm tiếp 0,2 ml natri nitrit. Nếu đục có thể lọc hay ly tâm. Để ổn định màu trong 10 phút. Sau đó đo độ hấp thụ quang học trên quang phổ kế ở bước sóng 650nm với cuvet 10mm. Dùng ống số 7 làm ống trắng để điều chỉnh máy.

Xây dựng đồ thị chuẩn với trục tung là các giá trị về độ hấp thụ quang học đo được, trục hoành là lượng tryptophan tính bằng mg tương ứng với các dung dịch chuẩn.

8. Tính toán kết quả.

8.1. Hàm lượng tryptophan trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

Trong đó:

- X₁ là hàm lượng trytophan trong mẫu thử, tính bằng %

- C là lượng tryptophan trong mẫu thử tìm thấy trên đồ thị chuẩn, tính bằng mg.

- m là khối lượng mẫu thử, tính bằng mg.

- 100 là hệ số quy về phần trăm.

Kết quả phép thử là trị số trung bình cộng của hai lần xác định song song trên cùng một mẫu thử nếu như sai khác giữa chúng không vượt quá 10%. Kết quả cuối cùng đựơc tính đến số lẻ thứ ba và làm tròn đến số lẻ thứ hai sau dấu phẩy.

8.2. Hàm lượng tryptophan tính theo chất khô được tính theo công thức sau:

Trong đó:

- X₂ là hàm lượng tryptophan trong mẫu thử theo chất khô, tính bằng%

- X₁ là hàm lượng tryptophan trong mẫu thử (8.1), tính bằng %.

- W là độ ẩm của mẫu thử, tính bằng %.

8.3. Tỷ lệ % của tryptophan so với protein trong mẫu thử được tính theo công thức:

Trong đó:

- X₃ là tỷ lệ của tryptophan so với protein trong mẫu thử, tính bằng %

- X₂ là hàm lượng tryptophan trong mẫu thử, tính bằng % chất khô

- Xp là hàm lượng protein trong mẫu thử (xác định theo phương pháp Kjeldahl), tính bằng % chất khô.

9. Báo cáo thử nghiệm.

Báo cáo thử nghiệm phải ghi những nội dung sau đây:

- Tất cả các thông tin cần thiết để xác định toàn diện về mẫu thử.

- Báo cáo phải bao gồm phương pháp thử đã áp dụng và kết quả thu được. Nếu kết quả hàm lượng trytophan thu được tính theo chất khô cần ghi rõ phương pháp xác định độ ẩm và giá trị độ ẩm cuả mẫu thử.

- Phương pháp lấy mẫu, nếu biết.

- Báo cáo cũng phải đề cập đến mọi chi tiết về thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này cũng như các chi tiết của bất kỳ yếu tố nào có ảnh hưởng tới kết quả.

KT. BỘ TRƯỞNG BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
THỨ TRƯỞNG





BÙI BÁ BỔNG

Phụ lục 1

PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN CƠM BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHO ĐIỂM

(Kèm theo Tiêu chuẩn 10 TCN 590-2004)

Họ tên: ………………………………….………………………………………..

Tuổi:  …...........................................…………………………………………..

Mẫu số: ………………………………….………………………………………

Ngày, giờ thử: ……...........................……………………………………………