Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 6836:2007 Xác định hàm lượng axit lactic và lactat trong sữa bột

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 6836:2007

ISO 8069:2005

SỮA BỘT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG

AXIT LACTIC VÀ LACTAT

Dried milk - Determination of content of lactic acid and lactates

Lời nói đầu

TCVN 6836:2007 thay thế TCVN 6836:2001;

TCVN 6836:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 8069:2005 /IDF 69:2005;

TCVN 6836:2007 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA BỘT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG

AXIT LACTIC VÀ LACTAT

Dried milk - Determination of content of lactic acid and lactates

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp enzym để xác định hàm lượng axit lactic và lactat của tất cả các loại sữa bột.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau :

2.1

hàm lượng axit lactic và lactat (lactic acid and lactates content)

khối lượng của các chất xác định được bằng phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng axit lactic và lactat được biểu thị bằng miligam axit lactic trên 100 gam chất khô không chứa chất béo.

3. Nguyên tắc

Phần mẫu thử của sữa bột được hoà tan trong nước ấm. Chất béo và protein được làm kết tủa và lọc. Dịch lọc được xử lý bằng các enzym và các chất sinh hoá, được bổ sung đồng thời theo thứ tự sau:

a) L-lactat dehydrogenaza (L-LDH) và D-lactat dehydrogenaza (D-LDH) trong sự có mặt của nicotinamit adenin dinucleotit (NAD) để oxi hoá lactat thành pyruvat và chuyền hoá NAD thành dạng khử của nó (NADH);

b) Glutamat pyruvat transaminaza (GPT) trong sự có mặt của L-glutamat để chuyển pyruvat thành L- alanin và chuyển L-glutamat thành -ketoglutarat.

Lượng NADH tạo thành được xác định bằng phép đo quang phổ ở bước sóng 340 nm và lượng này tỷ lệ thuận với hàm lượng axit lactic và lactat.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích. Nước dùng để chuẩn bị các dung dịch enzym phải được chưng cất ít nhất hai lần bằng dụng cụ thuỷ tinh và nước sử dụng cho các mục đích khác phải là nước được chưng cất bằng dụng cụ thuỷ tinh hoặc ít nhất có độ tinh khiết tương đương.

4.1. Dung dịch kali hexaxyanoferat (II), c(K₄[Fe(CN)₆].3H₂O) = 35,9 g/l.

Hoà tan trong nước 35,9 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm 3 phân tử nước. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và lắc đều.

4.2. Dung dịch kẽm sunfat, c(ZnSO₄.7H₂O) = 71,8 g/l.

Hoà tan trong nước 71,8 g kẽm sunfat ngậm 7 phân tử nước. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và lắc đều.

4.3. Dung dịch natri hydroxit

4.3.1. Dung dịch natri hydroxit I, c(NaOH) = 10 mol/l.

Hoà tan trong nước 400 g natri hydroxit (NaOH). Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và lắc đều.

4.3.2. Dung dịch natri hydroxit II, c(NaOH) = 0,1 mol/l.

Hoà tan trong nước 4,0 g natri hydroxit (NaOH). Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và lắc đều.

4.4. Dung dịch glyxerol (C₃H₈O₃), với glyxerol 50 % thể tích.

4.5. Dung dịch amoni sunfat, c[(NH₄)₂SO₄] =3,2 mol/l.

Hoà tan trong nước 422,84 g amoni sunfat. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và lắc đều.

4.6. Dung dịch đệm, pH 10.

Hoà tan 7,92 g glyxylglyxin (C₄H₈N₂O₃) và 1,47 g axit L-glutamic (C₅H₉NO₄) trong khoảng 80 ml nước. Chỉnh pH đến 10,0 ± 0,1 ở 20 ^oC bằng dung dịch natri hydroxit 10 mol/l, pha loãng bằng nước đến 100 ml và lắc đều.

Dung dịch này có thể giữ được 3 tháng, nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến + 5 ^oC.

4.7. Dung dịch nicotinamit adenin dinucleotit (NAD)

Hoà tan 350 mg nicotinamit adenin dinucleotit (C₂₁H₂₇N₇O₁₄P₂) trong 10 ml nước.

Dung dịch này có thể giữ được 4 tuần, nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 ^oC đến + 5 ^oC. Khi đang sử dụng dung dịch này, cần để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

4.8. L-Lactat dihydrogenaza (L-LDH), chiết từ cơ lợn.

Hòa tan 10 mg huyền phù L-Lactat dihydrogenaza trong 1 ml dung dịch glyxerol (4.4). pH của dung dịch thu được ở khoảng 7. Hoạt tính riêng của dung dịch L-lactat dehydrogenaza (L-LDH, EC 1.1.1.27) nên ít nhất là 5 500 đơn vị/ml ở 25 ^oC. Nếu không, phải chuẩn bị huyền phù L-LDH mới.

Dung dịch này có thể giữ được 12 tháng nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0^oC đến + 5^oC. Khi đang sử dụng dung dịch này, cần để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

4.9. D-Lactat dihydrogenaza (D-LDH), từ huyền phù Lactobacillus leichmannii.

Hoà tan 5 mg huyền phù D-LDH trong 1 ml dung dịch amoni sunfat (4.5). pH của dung dịch huyền phù thu được ở khoảng 6. Hoạt tính riêng của D - Lactat dehydrogenaza (D-LDH, ED 1.1.1.28) nên ít nhất là 1 500 đơn vị/ml ở 25 ^oC. Nếu không phải chuẩn bị huyền phù D-LDH mới.

Huyền phù D-LDH này có thể giữ được 12 tháng nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0^oC đến + 5 ^oC. Khi đang sử dụng huyền phù này, cần để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

4.10. Glutamat pyruvat transaminaza (GPT), chiết từ tim lợn.

Hoà tan 20 mg GPT trong 1,0 ml dung dịch amoni sunfat (4.5). pH của huyền phù thu được ở khoảng 7. Hoạt tính riêng của huyền phù (GPT, EC 2.6.1.2) phải ít nhất là 1 600 đơn vị /ml ở 25 ^oC. Nếu không, phải chuẩn bị huyền phù GPT mới.

Cho 1,0 ml dung dịch amoni sunfat (4.5) vào 1 ml huyền phù chứa 20 mg GPT và trộn đều. Cho ly tâm 2,0 ml huyền phù có chứa 10 mg GPT/ml trong khoảng 10 phút với gia tốc 4 000 g. Chuyển 1,0 ml phần dịch trong suốt phía trên, loại bỏ dung dịch còn lại và các hạt viên nhỏ.

Huyền phù này có thể giữ được 12 tháng nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0^oC đến + 5^oC. Khi đang sử dụng huyền phù này, cần để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

4.11. Dung dịch Liti L-lactat

Hoà tan trong nước 50 mg liti L-lactat (C₃H₅O₃Li). Pha loãng bằng nước đến 500 ml và lắc đều.

4.12. Dung dịch liti D-lactat

Hoà tan trong nước 50 mg liti D-lactat (C₃H₅O₃Li). Pha loãng bằng nước đến 500 ml và lắc đều.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau :

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg, có thể đọc được đến 0,1 mg.

5.2. Cốc thuỷ tinh có mỏ, dung tích 50 ml.

5.3. Ống đong chia độ, dung tích 50 ml.

5.4. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml.

5.5. Pipet, có thể phân phối 0,02 ml; 0,05 ml; 0,2 ml; 1,0 ml và 2,0 ml.

5.6. Pipet chia độ, có thể phân phối 5 ml, 10 ml, được chia vạch 0,1 ml.

5.7. Phễu lọc thuỷ tinh, đường kính khoảng 7 cm.

5.8. Giấy lọc, loại trung bình, đường kính khoảng 15 cm, không chứa axit lactic và lactat.

5.9. Đũa thuỷ tinh.

5.10. Dao trộn bằng chất dẻo, thích hợp để trộn hỗn hợp mẫu-enzym trong cuvet đo phổ.

5.11. Máy đo phổ, thích hợp để đo ở các bước sóng 340 nm, được gắn với các cuvet đo có chiều dài quang 1 cm.

5.12. Parafilm^TM1.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Bảo quản mẫu sao cho tránh được sự giảm chất lượng và thay đổi thành phần của mẫu.

7. Chuẩn bị

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Chuyển mẫu thử vào bình chứa có dung tích lớn gấp 2 lần thể tích mẫu, có nắp đậy kín khí. Đậy ngay nắp vật chứa. Trộn đều mẫu bằng cách lắc và đảo chiều bình chứa nhiều lần.

Trong quá trình chuẩn bị, không để mẫu thử tiếp xúc với không khí để hạn chế sự hấp thụ nước.

7.2. Phần mẫu thử

Cân 1,0 g mẫu thử chính xác đến 1 mg cho vào cốc thuỷ tinh 50 ml (5.2).

7.3. Phép thử trắng

Tiến hành phép thử trắng theo qui định trong 7.4 và 8.2, sử dụng tất cả các loại thuốc thử nhưng bỏ qua phần mẫu thử.

7.4. Chuẩn bị dung dịch và khử protein

7.4.1. Hoà tan phần mẫu thử (7.2) trong khoảng 20 ml nước được làm ấm trước ở nhiệt độ từ 40 ^oC đến 50 ^oC, đồng thời dùng đũa thuỷ tinh (5.9) để khuấy hoặc bằng cách thích hợp khác. Chuyển hết lượng chứa trong cốc thủy tinh sang bình định mút một vạch dung tích 100 ml (5.4), dùng nước để tráng cốc. Làm nguội lượng chứa trong bình đến khoảng 20 ^oC.

7.4.2. Cho thêm vào dung dịch (7.4.1) theo trật tự sau: 5,0 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (4.1), 5,0 ml dung dịch kẽm sunfat (4.2) và 10,0 ml dung dịch natri hydroxit II (4.3.2), lắc kỹ bình sau mỗi lần thêm. Pha loãng bằng nước đến vạch 100 ml. Lắc kỹ và để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

7.4.3. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc (5.8), loại bỏ phần dịch lọc đầu tiên.

Ly tâm là một biện pháp thay thế thích hợp cho việc lọc.

8. Cách tiến hành

CHÚ Ý - Tránh nhiễm bẩn, đặc biệt là mồ hôi.

8.1. Thử kiểm tra hoạt tính của thuốc thử

8.1.1. Bất kỳ mỗi mẻ thuốc thử mới (từ 4.6 đến hết 4.10) được chuẩn bị, hoặc khi các thuốc thử đó đã được bảo quản trong tủ lạnh chưa sử dụng quá 2 tuần, hoặc khi tiếp tục phân tích sau một thời gian gián đoạn hoặc khi các điều kiện khác đều đáp ứng, thì tiến hành phân tích về độ thu hồi lactat.

8.1.2. Dùng pipet lấy dung dịch liti L-lactat (4.11) cho vào hai bình định mức một vạch dung tích 100 ml (5.4), mỗi bình 10 ml. Tiếp theo dùng pipet lấy dung dịch liti D-lactat (4.12) cho vào hai bình định mức một vạch dung tích 100 ml (5.4) khác, mỗi bình 10 ml. Xác định hàm lượng axit L-lactic và lactat và axit D-lactic và lactat của các dung dịch trong các cặp bình 100 ml, tiến hành như qui định trong 7.4.2, 7.4.3 và 8.2.

8.1.3. Hàm lượng liti lactat, W_L, tính bằng miligam trên lit theo công thức:

a) đối với dung dịch L-lactat:

W_L = 341 x A

b) đối với dung dịch D-lactat:

W_L = 346 x A

trong đó

A là độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, được tính theo 8.2.1 và 8.2.2;

341 là giá trị của hệ số sau khi thay thế khối lượng phân tử của liti L-lactat (M_r= 96,1) và thể tích cuối cùng (V₁ = 2,24 ml) trong 9.1 khi độ thu hồi L-lactat được đánh giá;

346 là giá trị của hệ số sau khi thay thế khối lượng phân tử của liti D-lactat (M_r = 96,1) và thể tích cuối cùng (V₁ = 2,27 ml) trong 9.1 khi độ thu hổi D-lactat được đánh giá.

8.1.4. Cần tính đến độ sạch của liti L-lactat và liti D-lactat được dùng để chuẩn bị các dung dịch, độ thu hồi liti L-lactat hoặc liti D-lactat từ bất kỳ bình nào (8.1.2) cũng phải nằm trong khoảng 100 % ± 5 %. Nếu các độ thu hồi không nằm trong phạm vi này thì cần kiểm tra thuốc thử, kỹ thuật thao tác, độ chính xác của pipet và điều kiện của máy đo phổ. Thực hiện các công việc cần thiết để thu được kết quả thích hợp. Lặp lại phép thử cho đến khi thu được các kết quả thỏa đáng.

8.2. Xác định

8.2.1. Dùng pipet (5.5) chuyển vào cuvet của máy đo phổ (5.11) theo bảng 1:

Bảng 1 – Sơ đồ tiến hành

Hàm lượng axit L- hoặc D-lactic và lactat có thể xác định riêng rẽ bằng cách thêm L-LDH (4.8) hoặc D- LDH (4.9).

Khi cần đo axit L-lactic và lactat, thì độ hấp thụ có thể được xác định tương ứng sau 30 phút và 45 phút trộn.

8.2.2 Tính độ hấp thụ A cần để tính trong 9.1, bằng công thức :

trong đó

A_s60 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1 sau 60 phút;

A_s0 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1;

A_s45là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1 sau 45 phút;

A_b60 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1 sau 60 phút;

A_b0 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1;

A_b45 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1 sau 45 phút;

Đôi khi xảy ra phản ứng phụ từ từ. Ảnh hưởng của phản ứng phụ này lên độ hấp thụ có thể loại trừ bằng phép ngoại suy độ hấp thụ ở thời điểm bằng không.

Khi chỉ đo axit L-lactic và lactat (xem 8.2.1), thì độ hấp thụ có thể được đo sau 30 phút và 45 phút tương ứng. Khi đó công thức sẽ là:

trong đó

A_s60 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1 sau 30 phút;

A_b30 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1 sau 30 phút;

8.2.3. Nếu độ hấp thụ tính được trong 8.2.2 tăng quá 0,500 đơn vị, thì lặp lại các qui trình qui định trong 8.2.1 đến hết 8.2.3, sử dụng độ pha loãng thích hợp của dịch lọc thu được từ phần mẫu thử (7.4.3) và cả dung dịch thử trắng (7.3).

9. Tính toán và biểu thị kết quả

9.1. Tính toán

Hàm lượng axit lactic và lactat, w_L, được biểu thị theo miligam axit lactic trên 100 g chất khô không chứa chất béo, theo công thức sau:

trong đó

A là độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, tính được trong 8.2.2;

Mr là khối lượng phân tử của axit lactic (Mr = 90,1);

k là hệ số hấp thụ phân tử của NADH ở 340 nm, tức là 6,3 x 10⁶ cm²/mol;

/ là chiều dài đường quang của cuvet quang phổ, tính bằng xentimet (/ = 1 cm);

m là khối lượng phần mẫu thử (7.3). tính bằng gam;

V₁ là tổng thể tích chất lỏng trong cuvet đo (xem 8.2.1), tính bằng mililit:

- khi phải xác định cả axit D-lactic lẫn L-lactic và lactat, thì V₁ = 2,29 ml;

- khi chỉ phải xác định axit L-lactic và lactat, thì V₁ = 2,24 ml;

- khi chỉ phải xác định axit D-lactic và lactat, thì V₁  = 2,27 ml;

V₂ là thể tích dịch lọc (xem 7.4.3) trong cuvet đo của máy đo phổ (xem 8.2.1), tính bằng mililit;

V₃ là thể tích dịch lọc (xem 7.4.3) được dùng để pha loãng (xem 8.2.3), nếu cần, tính bằng mililit;

V₄ là thể tích của dung dịch trong 7.4.2 (V₄= 100 ml), tính bằng mililit;

V₅ là thể tích của dung dịch dùng để đã pha loãng mẫu thử (xem 8.2.3), nếu cần, tính bằng mililit;

w_s là hàm lượng chất khô không chứa chất béo của mẫu, được biểu thị theo phần trăm khối lượng.

CHÚ THÍCH Việc xác định hàm lượng chất béo không phải là một phần qui định trong tiêu chuẩn này. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo qui định trong ISO 1736.

9.2. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả thử nghiệm theo số nguyên.

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo TCVN 6910 (ISO 5725)2⁾.

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm đã được công bố (xem [5]). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải đã đưa ra.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ độc lập thu được, khi sử dụng cùng phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích sử dụng cùng một thiết bị, tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn:

a) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat ≤ 60 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 10 mg/100 g;

b) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat > 60 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 15 % (tương đối) trung bình cộng.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do các người phân tích khác nhau thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn:

a) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat ≤ 100 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 15 mg/100 g;

b) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat > 100 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 20 % (tương đối) trung bình cộng.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu độ lặp tại được kiểm tra thì nêu kết quả cuối cùng thu được

Phụ lục A

(qui định)

Các qui tắc thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) về thực hành phân tích bằng phương pháp enzym

A.1 Giới thiệu

Các qui tắc thực hành phòng thử nghiệm tốt về phân tích bằng phương pháp enzym là ít phổ biến hơn các phương pháp phân tích hoá học khác, cần chú ý hướng đến các qui tắc như vậy để thu được các kết quả có độ chụm và độ chính xác thoả đáng. Trước khi phân tích, đọc kỹ các qui tắc GLP dưới đây.

A.2 Thuốc thử

A.2.1 Chỉ sử dụng các enzym thuộc loại qui định (hoạt tính riêng, nồng độ, chất nhiễm bẩn có hoạt tính enzym, dung môi).

A.2.2 Chỉ sử dụng các coenzym thuộc loại qui định (loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, các chất nhiễm bẩn).

A.2.3 Tất cả các loại thuốc thử khác với enzym và coenzym phải thuộc loại phân tích.

A.2.4 Nước dùng để chuẩn bị các dung dịch enzym và thuốc thử khác phải là loại chưng cất hai lần bằng thiết bị thuỷ tinh.

A.2.5 Nước dùng để chuẩn bị các dung dịch mẫu phải là loại đã được chưng cất bằng dụng cụ thuỷ tinh hoặc đã khử ion.

A.2.6 Bảo quản các thuốc thử và các dung dịch/huyền phù enzym theo các chỉ dẫn (thường được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 ^oC  đến 8 °C).

A.2.7 Không làm đông lạnh các huyền phù enzym.

A.2.8 Khi thuốc thử đã quá hạn sử dụng, thì loại bỏ hoặc kiểm tra hiệu quả của thuốc thử bằng cách kiểm tra các dung dịch chuẩn bằng với các lượng chất phân tích khác nhau. Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với các nồng độ.

A.2.9 Các dung dịch đệm được lấy ra từ tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi cho vào hỗn hợp phân tích.

A.3 Cuvet đo phổ và quang phổ

A.3.1 Sử dụng cuvet bằng thuỷ tinh hoặc bằng chất dẻo có chiều dài đường quang 1 cm.

CHÚ THíCH Các cuvet bằng chất dẻo có các ưu điểm hơn các cuvet bằng thuỷ tinh như sau:

a) giá rẻ (có thể dùng một lần);

b) có thể thực hiện một số lượng lớn hơn các phép phân tích;

c) trong cùng một mẻ, các cuvet bằng chất dẻo cho độ hấp thu giống nhau.

A.3.2 Bất kỳ khi nào một mẻ cuvet mới được đưa vào sử dụng, thì kiểm tra chiều dài đường quang của chúng dựa vào các cuvet chuẩn (ví dụ: cuvet thạch anh), như sau:

Đổ đầy nước vào cuvet chuẩn và cuvet bằng chất dẻo rồi đo độ hấp thụ (A₁) của từng cuvet dựa vào nước. Sau khi tráng sạch, đổ đầy dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo độ hấp thụ (A₂) dựa vào nước. Tính A₂ - A₁, đối với cả hai cuvet chuẩn và cuvet bằng chất dẻo này. Nếu chênh lệch của (A₂ - A₁) giữa hai loại cuvet này vượt quá 0,5 % của phép đo độ hấp thụ đối với cuvet chuẩn, thì tính phần trăm chênh lệch trung bình và được tính đến đối với chiều dài đường quang, /, bằng công thức (3).

A.3.3 Luôn luôn sử dụng các cuvet sạch, không bị xước. Chỉ dùng khăn lau mềm để lau khô hoặc làm sạch các mặt của cuvet quang.

A.3.4 Không nên đo độ hấp thụ của các cuvet mẫu thử dựa vào độ hấp thụ của cuvet mẫu trắng, vì sẽ không thu được thông tin về cường độ hấp thụ của chính mẫu thử trắng. Đo độ hấp thụ của mẫu thử và cuvet thử trắng dựa vào nước và tính độ chênh lệch.

A.3.5 Không đo độ hấp thụ của mẫu hoặc cuvet thử trắng dựa vào cuvet rỗng (vì khuếch tán ánh sáng).

A.3.6 Dùng dao trộn để trộn đều các lượng chứa trong cuvet hoặc bằng cách dùng parafilm hàn kín cuvet rồi xoay cuvet.

A.3.7 Đuổi bỏ bọt khí ra khỏi cuvet bằng dao trộn. Tránh làm xước mặt quang của cuvet.

A.3.8 Luôn luôn sử dụng cùng một loại cuvet để đo mẫu thử và đo mẫu trắng.

A.3.9 Luôn luôn đặt cuvet thuỷ tinh hoặc cuvet thạch anh đúng một vị trí trong giá đỡ cuvet. Với mục đích này, đánh dấu một mặt quang của cuvet.

A.4 Máy đo phổ và máy đo quang phổ

A.4.1 Sử dụng máy đo quang phổ (độ rộng dải < 10 nm), gồm một máy đo quang có lọc với bộ lọc nhiễu (độ rộng dải < 10 nm), hoặc máy đo quang phổ vạch có đèn hơi thuỷ ngân. Sử dụng máy đo quang phổ hoặc máy đo quang có lọc để đo ở độ hấp thụ cực đại của NADH hoặc NADPH, nghĩa là ở 340 nm. Thực hiện đo sử dụng máy đo quang phổ vạch có đèn hơi thuỷ ngân ở 365 nm hoặc 344 nm.

CHÚ THÍCH Các hệ số hấp thụ phân tử của NADH hoặc NADPH được đo ở 334 nm, 340 nm và 365 nm như sau:

a) NADH hoặc NADPH ở 334 nm (Hg): 6,18 x 10⁶ cm²/mol;

b) NADH hoặc NADPH ở 340 nm: 6,3 X 10⁶ cm²/mol;

c) NADPH ở 365 nm (Hg): 3,5 X 10⁶ cm²/mol;

d) NADH ở 365 nm: 3,4 x 10⁶ cm²/mol;

A.4.2 Mối liên quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ của NADH hoặc NADPH tồn tại cho đến độ hấp thụ 2,0. Kiểm tra độ tuyến tính như sau:

a) dùng pipet lấy 2,00 ml nước cất cho vào cuvet và đo độ hấp thụ A₀ dựa vào nước;

b) dùng pipet lấy 0,10 ml dung dịch NADH (0,5 mg/ml) cho vào cuvet; trộn đều các lượng chứa trong cuvet và đo độ hấp thụ A₁.

Tính độ hấp thụ bị giảm, A_m, bằng công thức sau:

Lặp lại qui trình kiểm tra tuyến tính 14 lần như mô tả ở trên.

Sau mỗi cặp phép đo, tính độ hấp thụ bị giảm, A_m, bằng công thức sau:

trong đó

A_n là độ hấp thụ thu được tại phép đo thứ n;

V là thể tích của lượng chứa trong cuvet tại đo thứ n.

Mỗi lần đo, vẽ đồ thị giữa thể tích của dung dịch NADH có trong cuvet và độ hấp thụ giảm tương ứng.

A.5 Pipet tự động và các dụng cụ phân phối khác

A.5.1 Sử dụng pipet tự động và các dụng cụ phân phối khác theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

A.5.2 Sử dụng các đầu tip thích hợp cho từng pipet.

A.5.3 Kiểm tra định kỳ (ví dụ: kiểm tra hàng tháng) các yêu cầu về dung tích và độ lăp lại của các pipet tự động và các dụng cụ phân phối khác như sau:

Cân cốc thuỷ tinh có mỏ cùng với nước tại thời điểm t. Sau đó dùng pipet hoặc dụng cụ phân phối khác lấy một lượng nước đo được cho vào cốc có mỏ và cân chính xác tại thời điểm (t + 1) sau lần cân thứ nhất. Lặp lại qui trình hút pipet hoặc dùng dụng cụ phân phối chín lần. Không sử dụng pipet hoặc dụng cụ phân phối, cân cốc có mỏ tại các thời điểm thứ (t + 11), (t + 12), (t + 13), (t + 14) và (t + 15) phút. Tính hao hụt khối lượng do bay hơi sau mỗi phút. Tính thể tích và độ lặp lại của mỗi pipet hoặc mỗi dụng cụ phân phối, có tính đến hao hụt lượng nước đã bay hơi.

A.5.4 Nhiệt truyền từ lòng bàn tay trong suốt quá trình sử dụng có thể ảnh hưởng đến dung tích của một số pipet tự động.

Kiểm tra hiện tượng này bằng qui trình mô tả trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet như thế.

A.5.5 Ngay trước khi sử dụng, tráng đầu tip vài lần bằng dung dịch/huyền phù cần phân phối. Đối với mỗi dung dịch mẫu, sử dụng một pipet mới.

A.5.6 Dùng pipet hút dung dịch mẫu, dung dịch đệm, enzym, coenzym, trong khi đầu tip càng ngập sâu trong cuvet càng tốt và tại các vị trí khác nhau trong cuvet.

Có thể dùng pipet để lấy các lượng nhỏ dung dịch/huyền phù enzym (10  - 15 ) cho lên dao trộn đưa vào cuvet và dùng dao trộn để trộn đều lượng chứa trong cuvet.

A.5.7 Tránh nhiễm bẩn.

A.6 Các thông tin bổ ích khác

A.6.1 Kiểm tra khả năng gây nhiễu và sai số chéo bằng cách xác định độ hấp thụ của hai dung dịch có các nồng độ chất phân tích khác nhau. Độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích.

A.6.2 Sử dụng chất chuẩn để kiểm tra các phản ứng enzym. Chất chuẩn này được coi là chuẩn làm việc.

CHÚ THÍCH Các chất chuẩn phải có độ tinh khiết được công nhận bởi cơ quan chuẩn Quốc gia.

A.6.3 Tiến hành phép thử thu hồi với sự có mặt của dung dịch mẫu. Lượng chất phân tích được bổ sung vào phải gần giống với lượng vốn có trong dung dịch mẫu.

A.6.4 Sử dụng một dao trộn bằng chất dẻo cho một cuvet hoặc mỗi lần chỉ sử dụng một dao trộn.

CHÚ THÍCH Lượng chất lỏng còn dính trên dao trộn có thể coi như không đáng kể.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707) Sữa vả sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 7084:2002 (ISO 1736:2000) Sữa bột và sản phẩm sữa bột. Xác định hàm lượng chất béo. Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn).

[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] LEENHEER J. and JANS J.A. Bulletin of the IDF, No.207, 1986, pp. 122-132.