Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7749:2007 Thực phẩm - Phát hiện chiếu xạ bằng phép thử sao chổi AND

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 7749:2007

THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN CHIẾU XẠ BẰNG PHÉP THỬ SAO CHỔI ADN – PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC

Foodstuffs – DNA comet assay for the detection of irradiated foodstuffs – Screening method

Lời nói đầu

TCVN 7749:2007 hoàn toàn tương đương với EN 13784:2002;

TCVN 7749:2007 do Tiểu ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F5/SC1 Thực phẩm chiếu xạ biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN CHIẾU XẠ BẰNG PHÉP THỬ SAO CHỔI ADN – PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC

Foodstuffs – DNA comet assay for the detection of irradiated foodstuffs – Screening method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sàng lọc đối với thực phẩm có chứa ADN. Phương pháp này dựa trên vi bản gel điện di của các tế bào đơn hoặc các nhân tế bào để phát hiện sự đứt mạch ADN được cho là do xử lý chiếu xạ [1] đến [8]. Phương pháp phân tích sao chổi ADN không được quy định riêng cho xử lý chiếu xạ, vì vậy những kết quả phát hiện dương tính trên các đối tượng thực phẩm bằng phép thử này nên được kiểm tra để khẳng định lại bằng các phương pháp đã được chuẩn hóa, ví dụ TCVN 7408 (EN 1784), TCVN 7409 (EN 1785), TCVN 7410 (EN 1786) hoặc TCVN 7411 (EN 1787) và prEN 13751 phụ thuộc vào loại thực phẩm tương ứng.

Các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đã thực hiện thành công trên các sản phẩm có nguồn gốc cả động vật và thực vật như các loại thịt [9] đến [11], hạt giống, quả khô và các loại gia vị [6], [12]. Các nghiên cứu khác [13] đến [32] đã chứng minh rằng phương pháp này có thể áp dụng cho nhiều loại thực phẩm, tuy nhiên cũng có một số hạn chế còn tồn tại (xem điều 8).

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Sự đứt mạch ADN có thể xảy ra do nhiều tác nhân vật lý và hóa học khác nhau kể cả do bức xạ ion hóa. Khi thực phẩm chứa ADN bị xử lý bức xạ ion hóa, thì sự biến đổi của các phân tử lớn này sẽ xảy ra bao gồm cả việc đứt mạch ADN do đứt mạch ADN đơn hoặc xoắn kép. Việc đứt mạch này có thể được nghiên cứu trên vi bản gel điện di của các tế bào đơn lẻ hoặc của nhân tế bào. Chúng được gắn lên phiến kính hiển vi bằng agaroza, được phân giải để phá vỡ màng bằng một loại chất tẩy rửa, sau đó được điện di với các điện áp khác nhau. Các đoạn mạch ADN sẽ duỗi ra và di chuyển khỏi tế bào tạo thành một cái đuôi hướng về cực dương (anôt) làm cho các tế bào bị tổn thương có hình dạng sao chổi. Phép thử sao chổi kiểm tra sự tổn thương của ADN có thể tiến hành trong các điều kiện khác nhau. Tiến hành kiểm tra trong cả môi trường kiềm và môi trường trung tính. Thông thường, trong môi trường kiềm có thể kiểm tra được cả sự đứt mạch ADN ở mạch đơn và mạch xoắn kép và cả những vị trí không bền với kiềm, trong khi đó ở môi trường trung tính chỉ có thể quan sát được sự đứt mạch ADN xoắn kép. Tuy nhiên, trong điều kiện trung tính [1], sự đứt ADN ở mạch đơn cũng có những ảnh hưởng tới sự xuất hiện của sao chổi đó là do sự duỗi ra của mạch ADN cuộn tròn trong nhân tế bào [7], [8]. Tế bào bị chiếu xạ sẽ biểu hiện ở sự duỗi dài ADN tăng lên từ nhân hướng về cực dương và có thể coi như là một sao chổi dài hơn (bị đứt nhiều hơn) so với những tế bào chưa chiếu xạ. Những tế bào chưa chiếu xạ có biểu hiện ở dạng gần như hình tròn với cái đuôi rất mờ nhạt (xem hình A.1).

Tiêu chuẩn này mô tả việc sử dụng agaroza đơn lớp điện di trong môi trường pH trung tính, ở điện áp thấp và thời gian điện di ngắn.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Trong quá trình phân tích chỉ sử dụng những loại thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, và nước phải có chất lượng ít nhất là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có các quy định khác.

4.2. Axit clohydric (HCl), nồng độ c(HCl) = 1 mol/l).

4.3. Dimetylsulfoxit, DMSO1) (tùy chọn).

4.4. Dung dịch đệm muối phosphat, (PBS), pH 7,4

Hòa tan 8,0 g natri clorua, 0,2 g kali clorua, 2,94 g dinatri hydro phosphat ngậm mười hai phân tử nước (Na₂HPO₄.12H₂O) và 0,24 g kali dihydro phosphat (KH₂PO₄) trong 900 ml nước, chỉnh pH đến 7,4 bằng vài giọt axit clohydric (4.2) và chỉnh thể tích đến 1000 ml bằng nước. Dung dịch này cần được hấp áp lực hoặc lọc khử trùng trước khi sử dụng.

4.5. Dung dịch agaroza lót, 0,5 % agaroza trong nước cất

Hòa tan 50 mg agaroza trong 10 ml nước bằng cách đun sôi hoặc đun sôi bằng lò vi sóng (tan hoàn toàn, dung dịch trong). Giữ dung dịch này trong nồi cách thủy ở 45 ^oC để phủ lót các phiến kính hiển vi.

4.6. Dung dịch gel cố định, 0,8 % agaroza trong dung dịch đệm PBS

Hòa tan 80mg aga loại có nhiệt độ nóng chảy thấp trong 10 ml PBS (4.4) bằng cách đun nóng thông thường hoặc bằng lò vi sóng. Giữ dung dịch này trong nồi cách thủy có nhiệt độ 45 ^oC, sẵn sàng cho việc trộn với dịch huyền phù tế bào để cố định gel trên các phiến kính.

4.7. Dung dịch gốc EDTA, c(EDTA) = 0,5 mol/l

Cho 93,05 g axit etylendiamintetraaxetic, muối dinatri ngậm hai phân tử nước vào 300 ml nước cất, lắc đều và chỉnh pH đến 8,0 bằng dung dịch NaOH 40 %. Pha loãng bằng nước cất đến 500 ml và hấp áp lực.

4.8. Dung dịch gốc TBE

Hòa tan 54 g Tris(hydroxymetyl) aminometan (kiềm Tris) và 27,5 g axit boric vào 20 ml dung dịch gốc EDTA (4.7), pha loãng bằng nước cất đến 1 000 ml (TBE). Dung dịch gốc TBE này có thể được bảo quản trong bình thủy tinh ở nhiệt độ phòng. Nếu dung dịch hình thành kết tủa thì phải loại bỏ.

4.9. Dung dịch đệm điện di

Pha loãng một phần thể tích dung dịch gốc TBE (4.8) với chín phần nước. Chỉnh pH đến 8,4, nếu cần.

4.10. Dung dịch đệm phân giải

Hòa tan 25 g natri dodexylsulfat (SDS) vào dung dịch đệm điện di (4.9) và chỉnh thể tích đến 1000 ml.

4.11. Dung dịch nhuộm màu

4.11.1. Dung dịch gốc acridin da cam 2)

Hòa tan 100 mg acridin da cam trong 100 ml nước. Giữ nơi tối ở nhiệt độ khoảng từ 4 ^oC đến 6 ^oC.

4.11.2. Dung dịch nhuộm màu acridin da cam²⁾

Pha loãng 0,5 ml dung dịch gốc acridin da cam (4.11.1) bằng PBS (4.4) đến 100 ml. Dung dịch này có thể bảo quản đến một tuần ở nhiệt độ từ 4 ^oC đến 6 ^oC.

4.11.3. Dung dịch gốc propidium iodua²⁾

Hòa tan 100 mg propidium iodua trong 100 ml nước. Giữ nơi tối ở nhiệt độ khoảng 4 ^oC đến 6 ^oC.

4.11.4. Dung dịch nhuộm màu propidium iodua

Pha loãng từ 1 ml đến 5 ml dung dịch gốc propidium iodua (4.11.3) bằng PBS (4.4) đến 100 ml.

4.11.5. Dung dịch gốc ethidi bromua²⁾

Hòa tan 100 mg ethidi bromua trong 100 ml nước. Giữ nơi tối ở nhiệt độ khoảng 4 ^oC đến 6 ^oC.

4.11.6. Dung dịch nhuộm màu ethidi bromua

Pha loãng 2 ml dung dịch gốc ethidi bromua (4.11.5) bằng nước đến 100 ml.

4.11.7. Nhuộm màu bạc

4.11.7.1. Yêu cầu chung

Dung dịch nhuộm màu bạc và quy trình nhuộm màu [33] nêu dưới đây đã được dùng trong kiểm tra liên phòng thử nghiệm [6]. Các quy trình nhuộm màu khác như sử dụng các kit nhuộm màu bạc dùng cho axit nucleic có bán sẵn đều có thể được sử dụng với điều kiện là chúng thỏa mãn được các yêu cầu.

4.11.7.2. Dung dịch hãm màu A

Thêm 50 g kẽm sulfat, 50 g glyxerol vào 150 g axit tricloroaxetic và pha loãng đến 1000 ml bằng nước.

4.11.7.3. Dung dịch nhuộm màu B

Hòa tan 12,5 g natri cacbonat trong nước và chỉnh thể tích đến 250 ml.

4.11.7.4. Dung dịch nhuộm màu C

Hòa tan trong nước 100 mg amoni nitrat, 100 mg bạc nitrat, 500 mg axit tungstosilic, thêm vào 250 ml formaldehyl (tối thiểu là 37 %) và pha loãng bằng nước đến 500 ml.

4.11.7.5. Dung dịch nhuộm màu D

Ngay trước khi sử dụng, thêm 68 ml dung dịch nhuộm màu C (4.11.7.4) vào 32 ml dung dịch nhuộm màu B (4.11.7.3) đã được khuấy mạnh.

4.11.7.6. Dung dịch dừng E

Pha loãng 10 ml axit axetic băng bằng nước đến vạch 1 000 ml.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Bồn điện di DNA nằm ngang:

5.2. Nguồn điện, ví dụ 0 V đến 100 V, 0 mA đến 400 mA.

5.3. Đồng hồ hẹn giờ.

5.4. Cân.

5.5. Nồi cách thủy.

5.6. Máy khuấy từ gia nhiệt.

5.7. Lò vi sóng.

5.8. Vải lọc, cỡ lỗ 100 mm, 200 mm và 500 mm, ví dụ nylon.

5.9. Phiến kính hiển vi, (76 mm x 26 mm) được làm mờ một đầu.

5.10. Lamen, (24 mm x 60 mm).

5.11. Bình nhuộm màu.

5.12. Kính hiển vi.

Đối với trường hợp nhuộm màu bạc ADN thì có thể sử dụng kính hiển vi truyền qua thông thường nào, nhưng trong trường hợp nhuộm màu huỳnh quang thì phải cần có kính hiển vi huỳnh quang với kính lọc đã được cài đặt, ví dụ bước sóng 460 nm đến 485 nm (bức xạ xanh da trời) đối với thuốc nhuộm acridin da cam hoặc bước sóng 515 nm đến 560 nm (bức xạ màu xanh lá cây) kết hợp với kính lọc cản tại bước sóng 590 nm đối với thuốc nhuộm ethidi bromua hoặc propidium iodua.

Kính hiển vi phải có độ khuếch đại từ 100 lần đến 400 lần.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị huyền phù tế bào đơn.

6.1.1. Yêu cầu chung

Để đánh giá các phiến kính đã chạy điện di một cách phù hợp thì việc phân bố các tế bào trong agaroza gel phải đồng đều, tránh chồng lấp lên nhau. Nếu có quá ít tế bào, thì có thể tăng lượng mô lên và ngược lại. Huyền phù tế bào có thể được bảo quản trong đá nhưng không quá 10 min. Khi bổ sung DMSO từ 5% đến 10% làm chất chống đông thì huyền phù tế bào có thể bảo quản được lâu hơn ở nhiệt độ -18 ^oC.

6.1.2. Mô động vật

6.1.2.1. Tủy xương

Chẻ xương ra (ví dụ xương ống chân gà) và chuyển khoảng 50 mg tủy xương cho vào ống nghiệm cùng với 3 ml PBS đã được làm lạnh bằng đá. Dùng đũa thủy tinh khuấy để tạo huyền phù tế bào. Lọc huyền phù qua vải lọc cỡ lỗ là 100mm. Giữ dịch lọc này trong đá lạnh. Sử dụng phần dịch bên trên cho các phép phân tích tiếp theo.

6.1.2.2. Mô cơ

Nạo lấy lớp mô (không chứa chất béo nhìn thấy được bằng mắt thường) hoặc cắt ra thành từng lát thật mỏng bằng dao mổ và cho khoảng 1 g vào cốc có mỏ cùng với 5 ml PBS đã làm lạnh bằng đá. Làm lạnh cốc này bằng cách đặt trong một cốc khác to hơn chứa đá xay và xoay trong 5 min với tốc độ khoảng 500 vòng/min. Trước tiên lọc huyền phù này qua vải lọc có đường kính lỗ 500 mm, sau đó lọc tiếp qua vải lọc có đường kính lỗ 200 mm. Để lắng trong đá khoảng 5 min. Sử dụng phần dịch bên trên làm dịch chiết tế bào.

6.1.3. Mô thực vật

6.1.3.1. Hạt giống, quả hạch và gia vị

Dùng cối và chày nghiền khoảng 0,25 g mẫu (nếu mẫu có vỏ thì loại bỏ vỏ trước khi nghiền, thỉnh thoảng ngâm trong nước cho dễ loại bỏ vỏ) sau đó chuyển vào cốc có mỏ cùng với 3 ml PBS đã được làm lạnh bằng đá. Đặt cốc mẫu này vào trong một chiếc cốc to hơn có chứa đá vụn để làm lạnh và xoay trong 5 min với tốc độ khoảng 500 vòng/min. Trước tiên, lọc huyền phù này qua vải lọc có đường kính lỗ 200 mm, sau đó lọc tiếp qua vải lọc có đường kính lỗ 100 mm. Để lắng trong đá vụn khoảng 15 min đến 60 min. Thời gian càng lâu thì dịch huyền phù càng ít bị nhiễm bẩn, nhưng cũng càng chứa ít tế bào/nhân tế bào. Sử dụng phần dịch bên trên cho các phép phân tích tiếp theo.

6.1.3.2. Dâu tây

Tách các mắt của quả dâu tây riêng ra bằng cách nhặt hoặc nghiền dâu tây với nhiều nước, để cho các mắt này lắng xuống và tách riêng chúng ra. Cân khoảng 0,25 g mắt dâu tây và tiến hành như đối với hạt giống, quả hạch hoặc gia vị (6.1.3.1).

6.1.3.3. Khoai tây

Cắt mô phân vi sinh khoai tây ra thành từng lát bằng dao mổ và chuyển khoảng 4g vào gốc có mỏ có chứa 5 ml PBS đã được làm lạnh bằng đá và tiến hành như đối với hạt, quả hạch và gia vị (6.1.3.1).

6.1.3.4. Hành

Cắt mô phân vi sinh của hành ra thành từng lát bằng dao mổ và chuyển khoảng 2 g vào cốc có mỏ có chứa 4 ml PBS đã được làm lạnh bằng đá và tiến hành như đối với hạt, quả hạch và gia vị (6.1.3.1).

6.2. Phủ lót agaroza gel lên phiến kính

Để tăng khả năng bám dính của agaroza gel lên phiến kính thì cần phủ một lớp lót mỏng agaroza lên trước. Trước khi phủ, phiến kính phải được ngâm trong metanol qua đêm để loại bỏ hết chất béo, sau đó để khô trong không khí. Phủ lớp lót lên phiến kính đã được làm sạch bằng cách nhỏ một giọt (khoảng 50 ml) dung dịch agaroza lót (4.5) ấm lên mặt phiến kính, sau đó xoa đều bằng một mặt phiến kính thứ hai và để khô trong không khí khoảng 30 min. Trước khi phủ, cũng có thể phủ lót bằng cách nhúng cả phiến kính vào dung dịch agaroza và lấy giấy mềm lau sạch một mặt. Phiến kính đã được phủ có thể bảo quản được vài tuần ở nơi sạch bụi.

6.3. Cố định gel

Trộn 100 ml huyền phù tế bào với khoảng 1 ml dung dịch gel cố định (4.6) còn ấm. Chuyển 100 ml hỗn hợp trên lên phiến kính và dùng đầu pipet dàn ra. Đậy ngay lại bằng lamen sao cho gel được dàn đều và tránh tạo bọt. Đặt phiến kính lên trên đá lạnh trong khoảng 5 min để làm đặc agaroza gel. Dùng đầu dao mổ dịch chuyển lamen sang một bên và nhẹ nhàng lấy phiến kính ra khỏi agaroza. Bản gel cần phải trộn thật đồng đều và không chứa bọt khí. Có thể chuẩn bị đồng thời tại một vài phiến kính như thế từ cùng một dung dịch gel.

6.4. Phân giải tế bào

Các phân đoạn ADN sẽ di chuyển ra khỏi tế bào trong quá trình điện di dưới những điều kiện có thể làm cho màng tế bào trở nên có tính thấm cao hơn. Do vậy, việc phân giải tế bào là cần thiết và không thể thiếu khi áp dụng phép thử sao chổi. Ngâm các phiến kính đã hoàn toàn ổn định vào dung dịch phân giải trong bình nhuộm màu ở nhiệt độ phòng tối thiểu 5 min đối với tế bào động vật và 15 min đối với tế bào thực vật. Không được chạm vào lớp agaroza. (Để kiểm tra sự phân giải hoàn toàn, tế bào có thể bị nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển vi: những tế bào đã bị phân giải sẽ cho thấy có khuếch tán của ADN ra khỏi tế bào).

6.5. Chuẩn bị điện di

Ngâm các phiến kính sau khi đã phân giải vào dung dịch đệm điện di (4.9) trong khoảng 5 min.

6.6. Tiến hành điện di

Đặt các phiến kính vào trong bồn điện di nằm ngang, đặt sát nhau, tránh để khoảng trống, đặt phía phiến kính mở hướng về cực âm (catôt). Đổ đầy dung dịch đệm điện di mới (4.9) vào bồn đến khi ngập quá phiến kính khoảng 2 mm đến 4 mm (không di chuyển các phiến kính). Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng ở điện thế 2 V/cm (điện thế áp dụng/ khoảng cách giữa các điện cực) trong 2,0 min. Sau khi kết thúc, tắt nguồn điện và cẩn thận lấy phiến kính ra khỏi bồn và ngâm trong nước 5 min. Để khô trong không khí trong 1 h hoặc sấy trong tủ sấy phòng thử nghiệm ở nhiệt độ 40 ^oC đến 50 ^oC.

6.7. Nhuộm màu

6.7.1. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

Các phiến kính phải được nhuộm màu ngay trước khi quan sát vì nếu để lâu thuốc nhuộm sẽ bay màu.

6.7.1.1. Acridin da cam

Ngâm các phiến kính trong dung dịch nhuộm màu acridin da cam (4.11.2) từ 3 min đến 5 min. Rửa phiến kính bằng cách ngâm trong nước khoảng 0,5 min đến 1 min. Trước khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang, dùng lamen đậy lại và loại bỏ nước thừa ra khỏi phiến kính. Quan sát ngay vì phiến kính khô sẽ rất khó quan sát.

Tránh để phiến kính tiếp xúc quá lâu dưới ánh sáng vì có thể sẽ làm phai màu. Nếu đã nhuộm màu quá nhiều thì có thể rửa bằng nước để làm nhạt nền huỳnh quang.

6.7.1.2. Propidium iodua

Ngâm phiến kính trong dung dịch nhuộm màu propidium iodua (4.11.4) từ 5 min đến 10 min. Rửa phiến kính và tiếp tục tiến hành như đối với acridin da cam (6.7.1.1).

6.7.1.3. Ethidi bromua

Tiến hành như đối với nhuộm màu bằng propidium iodua (6.7.1.2).

6.7.2. Nhuộm màu bạc

Ngâm phiến kính trong dung dịch cố định A (4.11.7.2) trong 10 min. Tráng bằng nước khoảng 1 min. Làm khô gel trong tủ sấy ở nhiệt độ 40 ^oC đến 50 ^oC trong 1 h hoặc làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng (có thể để qua đêm). Tiếp tục ngâm phiến kính trong dung dịch nhuộm màu D (4.11.7.5) trong khoảng từ 10 min đến 20 min. Nhuộm lại màu một hoặc hai lần nữa bằng dung dịch nhuộm màu D mới trong 5 min đến 10 min đến khi xuất hiện màu nâu xám trên phiến kính. Tráng bằng nước khoảng 1 min. Ngừng việc nhuộm màu bằng dung dịch dừng E (4.11.7.6) trong 5 min và tráng lại bằng nước trong khoảng 1 min. Làm khô phiến kính để nghiêng ở nhiệt độ phòng. Các phiến kính sẽ không bị bạc màu và có thể quan sát được dưới kính hiển vi khi bảo quản trong thời gian dài.

6.8. Nhận dạng

Để quan sát các phiến kính được nhuộm màu bằng arcidin da cam, cần một kính hiển vi huỳnh quang có bộ lọc, ví dụ: với bước sóng 460 nm đến 485 nm (bức xạ xanh da trời). ADN bị nhuộm màu (mạch xoắn kép) sẽ phát sáng xanh lá cây trong khi đó nền và mảnh tế bào sẽ có màu da cam.

Để quan sát các phiến kính được nhuộm màu bằng ethidi bromua và propidium iodua, cần một kính hiển vi huỳnh quang có bộ lọc, ví dụ: với bước sóng từ 515 nm đến 560 nm (bức xạ xanh lá cây) và kính lọc cản ở bước sóng 590 nm. ADN bị nhuộm màu sẽ phát sáng đỏ.

Đối với các phiến kính nhuộm màu bạc, có thể sử dụng bất kỳ kính hiển vi truyền qua thông thường nào.

7. Đánh giá

Việc đánh giá được tiến hành khi quan sát phiến kính dưới kính hiển vi, hàng trăm tế bào có thể được quan sát trong vòng vài phút. Hình mẫu được tạo thành bởi ADN đã nhuộm màu sau khi điện di sẽ phụ thuộc vào việc xử lý tế bào trước đó. Vì chiếu xạ gây ra sự đứt mạch ADN, nên có thể quan sát được sự xuất hiện của sao chổi. Tế bào chưa bị tổn thương sẽ có hình khối của nhân không có đuôi hoặc đuôi rất mờ nhạt, xem hình A.1, hình A.2 và hình A.3.

Hình dạng và sự phân bố của sao chổi trên phiến kính được đánh giá trước tiên ở độ khuếch đại thấp (100 lần) để xem xét tổng thể. Tiếp theo sao chổi ADN sẽ được kiểm tra chi tiết ở độ khuếch đại cao hơn (khoảng 200 lần, thậm chí 400 lần). Với liều chiếu xạ áp dụng đối với thực phẩm, thì sự đứt mạch ADN khá rõ. Vì thế, ở những mẫu chiếu xạ không quan sát được những tế bào còn nguyên mà chỉ thấy sao chổi, trong khi đó ở những mẫu chưa chiếu xạ thì luôn quan sát được một số tế bào còn nguyên không có đuôi hoặc có đuôi rất mờ nhạt. Mặc dù cũng có thể quan sát được các tế bào có hình dạng và độ dài khác nhau của sao chổi ở những mẫu chưa chiếu xạ nhưng nét đặc thù nhất của những mẫu này là sự có mặt của những tế bào không bị tổn thương.

Việc đánh giá định tính thực phẩm đã qua bức xạ ion hóa hay chưa, thường có thể kiểm tra bằng kính hiển vi. Thông thường, chỉ cần nhìn qua là có thể phân loại mẫu đã chiếu xạ hay chưa chiếu xạ. Cũng có thể đo hình dạng của sao chổi bằng một máy phân tích hình ảnh. Việc đo chiều dài hoặc diện tích sao chổi hoặc mômen của đuôi sao chổi hay đo hàm lượng ADN ở đầu hoặc đuôi sao chổi có thể cung cấp thêm thông tin [7], [8], [35], [36].

CHÚ THÍCH: Có thể đánh giá liều chiếu xạ bằng cách so sánh mẫu chưa biết liều với phiến kính của những mẫu đối chứng đã chiếu xạ với liều khác đã biết. Những mẫu đối chứng này được chuẩn bị từ những thực phẩm được chiếu xạ ở những liều đã biết (tốt nhất, những mẫu đối chứng này phải được chạy điện di cùng với mẫu chưa biết liều để đảm bảo chúng cùng một điều kiện nhận dạng)

8. Hạn chế

Về nguyên tắc, phép thử sao chổi ADN có thể áp dụng để phát hiện chiếu xạ ở bất kỳ loại thực phẩm nào có chứa ADN. Phép thử sao chổi này thực tế đã được áp dụng thành công trên nhiều loại thực phẩm, kể cả thực phẩm có nguồn gốc động vật như: gà, vịt, chim cút, gà lôi, thịt lợn, lợn lòi, thịt bò, bê, cừu, hươu, cá (cá hồi đỏ và cá hồi vàng cam) và thực phẩm có nguồn gốc thực vật như quả hạnh, quả vả, đậu lăng, đậu carioca và macaca, dâu tây, bưởi, hạt lanh, hạt vừng, hạt hướng dương, hạt tiêu.

Cần phải nhấn mạnh rằng phép thử sao chổi này chỉ có tác dụng sàng lọc và các kết quả của phép thử này cần được khẳng định thêm bằng kỹ thuật cụ thể khác dùng cho thực phẩm chiếu xạ, bởi vì sự đứt mạch ADN có thể bị gây ra bởi các nguyên nhân khác (xem ví dụ về hạt mù tạt trong đoạn 8 dưới đây).

Mỗi loại thực phẩm mới phải được thử nghiệm trước khi đưa vào phân tích: dung dịch phân giải, thời gian xử lý, thời gian điện di và cường độ điện trường đều có thể được thay đổi để phù hợp và thuận lợi cho sự di chuyển của ADN trong bản gel.

Hiện nay, sự hiểu biết về các mẫu sao chổi ADN của các loại thực phẩm khác nhau còn rất hạn chế, tốt nhất nên tiến hành trên nhiều loại thực phẩm từ nhiều nguồn khác nhau để biết được nhiều hơn sự biến đổi của các mẫu sao chổi. Cũng cần thiết phải nghiên cứu thêm về tác dụng của chiếu xạ và các thông số về bảo quản. Ngoài ra, việc chuẩn bị huyền phù tế bào cũng đóng vai trò rất quan trọng vì nó là bước không thể thiếu khi áp dụng phép thử sao chổi. Đối với một số loại thực phẩm như đu đủ, me [32] thực tế đã có nhiều mảnh vụn tế bào lẫn vào nền của sao chổi vì vậy khi chuẩn bị huyền phù tế bào cần phải thêm vào vài bước xử lý để có thể có được hình nền phù hợp. Đối với một số sản phẩm khác, khó có thể lấy được tế bào thích hợp, ví dụ một số loại quả hạch, gia vị, một số loại cá [31], [32]. Đối với thực phẩm đã qua xử lý nhiệt thì không có tế bào nào thích hợp vì các tế bào đã bị tổn thương nặng do nhiệt. Do đó, thông thường không thể tìm thấy tế bào phù hợp đối với sản phẩm tôm đã được chần, hay gà đã nấu chín bằng lò vi sóng [6].

Trong trường hợp các sản phẩm thịt, tùy thuộc vào điều kiện bảo quản (nhiệt độ và thời gian từ lò mổ đến phòng đông lạnh) của mẫu thịt tươi mà quá trình phân hủy ADN tự nhiên (dưới tác động của enzym) sẽ tạo ra sự đứt mạch ADN [37]. Vì vậy, hình dạng sao chổi cũng sẽ rất khác nhau. Sự có mặt của nhiều tế bào cho thấy rằng quá trình phân hủy ADN có thể chỉ là do điều kiện bảo quản quá kém. Quá trình làm lạnh-rã đông lặp đi lặp lại cũng sẽ làm tổn hại nặng nề ADN (đứt mạch). Mẫu hình sao chổi nhận được trong các trường hợp này cũng tương tự những gì nhận được trong trường hợp ADN bị phân hủy tự nhiên và chỉ có thể phân biệt được với những loại thực phẩm chiếu xạ mà cho những mẫu sao chổi đồng nhất [6]. Nếu tất cả các tế bào của mẫu thực phẩm đều cho thấy có sự phân hủy ADN từ trước thì không thể xác định được mẫu thực phẩm đó đã qua chiếu xạ hay chưa. Đó là hạn chế rõ ràng nhất của phép thử sao chổi ADN này.

Một hạn chế khác có thể xảy ra là quá trình phân giải tế bào để tạo tính thấm cho màng xảy ra không hoàn toàn, tính thấm của màng giúp cho ADN dễ dàng di chuyển ra khỏi nhân. Trong một số nghiên cứu trước đây [4], [5], [15], [17], [19], [20] quá trình phân giải đã xảy ra không hoàn toàn khi sử dụng dung dịch SDS nồng độ chỉ 0,1 %. Bằng việc tăng nồng độ SDS lên 2,5 % thì vấn đề này đã được khắc phục, ít nhất là đối với tế bào động vật [6]. Đối với một số tế bào thực vật, thời gian phân giải phải tăng lên ví dụ từ 30 min đến 60 min như đậu tương hoặc bưởi [6], [30]. Đối với một số loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật khác như bào tử Argaricus  bisporus (nấm mỡ), quá trình phân giải tế bào không thể hoàn thành [6], [19], và vì vậy phép thử sao chổi này cũng không thể áp dụng được. Có thể việc phân giải không hoàn toàn cũng là nguyên nhân xuất hiện những tế bào còn nguyên quan sát được ở những mẫu đã qua chiếu xạ ví dụ như đậu khô, quả hạnh thái lát [28], hạt đậu đỏ và me [32]. Dung dịch phân giải mạnh hơn, hoặc thời gian phân giải lâu hơn trong quá trình ủ ấm có thể sẽ giảm thiểu được vấn đề này.

Đối với một số loại thực phẩm việc chuẩn bị tế bào có thể thực hiện được nhưng những khó khăn trong việc phân biệt giữa mẫu đã chiếu xạ và chưa chiếu xạ, ví dụ đối với một số quả hạch, hạt giống hay gia vị [31]. Những khó khăn này cũng xảy ra đối với mẫu đã chiếu xạ liều thấp như hành và khoai tây [6] và [32]. Có thể việc sử dụng phân tích hình ảnh tinh vi sẽ giúp cho việc nhận dạng, nhưng nếu chỉ kiểm tra bằng mắt, thì người kiểm tra không chắc chắn mẫu đó đã chiếu xạ hay chưa chiếu xạ.

Một trường hợp đặc biệt đã quan sát được đối với hạt mù tạt, kết quả phép thử cho thấy mẫu này đã chiếu xạ với hình ảnh sao chổi rất rõ ràng và không có tế bào nguyên vẹn. Nhưng khi thử lại bằng phương pháp phát huỳnh quang nhiệt [TCVN 7412 (EN 1788)], thì cho thấy mẫu đó lại chưa chiếu xạ. Hơn nữa, khả năng nảy mầm của hạt mù tạt còn chứng tỏ rằng hạt chưa xử lý chiếu xạ [6]. Vấn đề tương tự cũng xảy ra với mẫu hạt kê. Mặc dù chỉ quan sát thấy những sao chổi khi phân tích mẫu, nhưng các phép thử khác như phát huỳnh quang nhiệt [TCVN 7412 (EN 1788)], hay sự tạo thành các hợp chất hydrocacbon từ các phần chất béo của thực phẩm [TCVN 7408 (EN 1784)] đều cho kết quả nhận dạng là mẫu chưa chiếu xạ. Có thể là trạng thái hạt giống, có thể là đang thời gian ngủ nghỉ hoặc không và có thể thể hiện được vai trò.

9. Thẩm định kết quả

Quy trình mô tả trong tiêu chuẩn này được dựa trên nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên các thực phẩm có nguồn gốc động vật (thịt gà, thịt lợn) [9] đến [11] và thực vật [6], [12] cũng như một số nghiên cứu tiến hành trên các thực phẩm khác [13] đến [32].

Trong một phép thử liên phòng thử nghiệm do Cục Quản lý thực phẩm Quốc gia Thụy Điển tổ chức, chín phòng thử nghiệm đã tham gia phân tích trên ba loại huyền phù tế bào đã mã hóa được chuẩn bị từ mẫu tủy xương gà, mô cơ gà và lợn đã chiếu xạ và chưa chiếu xạ. Liều chiếu xạ thay đổi từ liều 0 kGy, 1 kGy, 2,5 kGy, 3 kGy và 5 kGy. Trong tổng số 162 mẫu được gửi đi, đã ghi nhận được kết quả có giá trị từ 148 mẫu. Trong số đó có 138 kết quả nhận dạng đúng. Trong số 106 mẫu chiếu xạ, thì 99 mẫu đã được phát hiện đúng, có 39 mẫu trong tổng số 42 mẫu chưa chiếu xạ đã được phân loại đúng, xem bảng 1 [11].

Bảng 1 - Số liệu liên phòng thử nghiệm trên gà và lợn

Phải công nhận rằng có một số phòng thử nghiệm không có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng phép thử sao chổi này. Mặc dù mỗi phòng thử nghiệm đã nhận được các mẫu đối chứng được làm từ tủy xương gà chiếu xạ ở các liều 0 kGy, 1 kGy, 3 kGy, 5 kGy và được ghi nhãn với các liều đã chiếu xạ này, nhưng một số phòng thử nghiệm vẫn gặp những khó khăn khi sử dụng phương pháp này để phân tích. Tuy nhiên, có sáu phòng thử nghiệm đã thử nghiệm thành công trên tất cả các mẫu.

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm khác cũng đã được tiến hành trên các mẫu thực vật như quả hạnh, quả vả, đậu lăng, hạt lanh, hạt tiêu, vừng, đậu tương và hạt hướng dương. Các mẫu đã mã hóa bao gồm cả mẫu chưa chiếu xạ và chiếu xạ với liều 0,2 kGy, 1 kGy hay 5 kGy. Ngoài 20 mẫu đã mã hóa, các phòng thử nghiệm tham gia còn được cung cấp thêm 12 mẫu chiếu xạ với liều đã biết trước. Bốn phòng thử nghiệm tham gia so sánh kết quả. Trong tổng số 78 kết quả nhận được, thì có 74 kết quả đúng (95%). Các kết quả này được trình bày trong bảng 2.

Bảng 2 – Số liệu liên phòng thử nghiệm trên các tế bào thực vật (bảo quản 10 tháng sau chiếu xạ)

10. Báo cáo thử nghiệm

Bản báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả;

g) những điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc các lựa chọn tùy ý cùng với mọi chi tiết bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả;

i) tài liệu chứng minh phù hợp, ví dụ như ảnh chụp hiển vi sử dụng phim đen trắng hoặc phim màu (400 ASA hoặc tốt hơn). Cũng có thể dùng máy phân tích hình ảnh để cung cấp những tài liệu chứng minh này.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Thư mục tài liệu tham khảo

TCVN 7409 (EN 1785), Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ thực phẩm đối với loại thực phẩm chứa chất béo – Phân tích 2-alkylxyclobutanon bằng phương pháp sắc ký khí / quang phổ khối.

TCVN 7408 (EN 1784), Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ thực phẩm đối với loại thực phẩm chứa chất béo – Phân tích hydrocacbon bằng sắc ký khí.

TCVN 7410 (EN 1786), Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ thực phẩm đối với loại thực phẩm chứa xương – Phương pháp quang phổ ESR.

TCVN 7411 (EN 1787), Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ thực phẩm bằng phương pháp quang phổ ERS đối với loại thực phẩm chứa chất xenluloza.

TCVN 7412 (EN 1788), Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ thực phẩm bằng phương pháp nhiệt phát quang đối với loại có thể tách khoáng silicat.

TCVN 7747:2007 (EN 13708:2002) Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ đối với thực phẩm chứa đường tinh thể bằng phương pháp đo phổ ESR.

TCVN 7746:2007 (EN 13708:2002), Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ bằng phương pháp đo cường độ phát quang do kích thích ánh sáng.

[1] Ostling, 0., and Johanson, K. J.: Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem, Biophys. Res. Comm., 1984, 123, 291-298.

[2] Ostling, 0., and v.Hofsten, B.: Radiation-induced DNA strand breaks in single cells: Health Impact, Identification, and Dosimetry of Irradiated Foods, Report of a WHO Working Group, Edited by Bogl, K.W., Regulla, D.F., and Suess, M.J. Bericht des Instituts fur Strahlenhygiene des Bundesgesundheitsamtes. 1988, ISH-125, Neuherberg: Institut fur Strahlenhygiene des Bundesgesundheitsamtes, 305-307.

[3] Johanson, K.J.: The microelectrophoresis method, a method for determination of irradiated food.: Potential New Methods of Detection of Irradiated Food. Edited by Raffi, J. J., and Belliardo, J.J. BCR-Information.1991, Luxembourg: Commission of the European Community, 1991, (Report EUR/13331/en), 52-54.

[4] Cerda, H., v.Hofsten, B., and Johanson, K. J.: Identification of irradiated food by microelectrophoresis of DNA from single cells.: Recent advances on detection of irradiated food. Edited by Leonardi, M., Raffi, J.J., and Belliardo, J.-J. BCR-Information. 1993, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993, (Report EUR/14315/en), 401-405.

[5] Cerda, H.: Analysis of DNA in fresh meat, poultry and fish. Possibility of identifying irradiated samples: Changes in DNA for the detection of irradiated food. Edited by Delincee, H., Marchioni, E., and Hasselmann, C. BCR-Information. 1993, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993, (Report EUR/15012/en), 5-6.

[6] Cerda. H., Delincee, H., Haine, H., and Rupp, H.: The DNA “comet assay” as a rapid screening technique to control irradiated food. Mutation Res., 1997, 375, 167 – 181.

[7] McKelvey-Martin, V. J., Green, M. H. L., Schmezer, P., Pool-Zobel, B. L., De Meo, M. P., and Collins, A.: The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): A European review. Mutation Res., 1993, 288, 47 – 63.

[8] Fairbairn, D. W., Olive, P. L., and O’Neill, K. L.: The comet assay: a comprehensive review. Mutation Res., 1995, 339, 37-59.

[9] Delincee, H.: Application of the DNA “Comet Assay” to detect irradiation treatment of foods.: Detection Methods for Irradiated Foods – Current Status. Edited by McMurray, C.H., Stewart, E.M., Gray, R., and Pearce, J.Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 1996, 349-354.

[10] Haine, H., Cerda, H., and Jones, L: Microgel electrophoreris of DNA to detect irradiation of foods. Food Sci. Technol. Today, 1995, 9, 139 – 140.

[11] Cerda, H.: Detection of irradiated frozen meat with the comet assay. Interlaboratory test. J.Sci.Food Agric, 1998,76,435-442.

[12] Haine, H. E., Cerda, H., and Jones, J. L: Detecting irradiation of seeds using microgel electrophoresis (a collaborative trial). Campden & Chorleywood Food Research Association, R&D Report No. 10. MAFF Project No. 19456, 1995, 1-16.

[13] Nilson, H., and Cerda, H: Analys av bestraalade livsmedel – verksamhetsraport under perioden 989/90 – 1992/93. Uppsala: National Food Administration, 1993, SLV rappot 1993, nr. 17.

[14] Leth, T., Eriksen, H., Sjoberg, A.-M., Hannisdal, A., Nilson, H., and Cerda, H.: Pavisning af bestraling – to analysemetoder. Konsument Tema Nord, 1994, 609, Copenhagen: Nordic Council of Ministers, 1994, 1-26.

[15] Haine, H. E., and Jones, J. L: The analysis of DNA fragmentation as a method for detecting irradiation of food. Campden Food and Drink Association, Technical Memorandum No. 711, 1992, 57-59.

[16] Haine, H. E., and Jones, L: Microgel electrophoresis of DNA as a method to detect irradiated foods. Food Sci. Technol. Today, 1994, 8, 103-105.

[17] Delincee, H.: Micro gel electrophoresis of chicken DNA to detect radiation processing.: Changes in DNA for the detection of irradiated Food. Edited by Delincee. H., Marchioni, E., and Hasselmann, C. BCR-Information, 1993, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993, (Report EUR/15012/en), 7.

[18] Delincee, H., and Marchioni, E.: Intercomparison, study with micro gel electrophoresis of DNA for detection of irradiated chicken: a preliminary trial.: Changes in DNA for the detection of irradiated food. Edited by Delincee, H., Marchinoni, E., and Hasselmann, C. BCR-Information. 1993, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993, (Report EUR/15012/en), 8-14.

[19] Delincee, H.: Detection of the irradiation treatment of food using micro gel electrophoresis of DNA.: New Developments in Food, Feed and Waste Irradiation. Edited by Schreiber, G. A., Helle, N., Bogl, K. W. Bericht des Insituts fur Sozialmedizin und Epidemiologie des Bundesgesundheitsamtes, 1993, Berlin: Bundesgesundheitsamt, Soz-Ep Heft 16/1993, 112-116.

[20] Leffke, A., Helle, N., Bogl, K.-W., and Schreiber, G. A.: DNA-Electrophoresis of single cells – A method to screen for irradiated foodstuffs: New Developments in Food, Feed and Waste Irradiation. Edited by Schreiber, G. A., Helle, N., Bogl, K. W. Bericht des Instituts fur Sozialmedizin und Epidemiologie des Bundesgesundheitsamtes, 1993, Berlin: Bundesgesundheitsamt, Soz-Ep Heft 16/1993, 117-121.

[21] Raffi, J., Delincee, H., Marchioni, E., Hasselmann, C, Sjoberg, A-M., Leonardi, M., Kent, M., Bogl, K. W., Schreiber, G., Stevenson, H., and Meier, W.: Concerted action of the Community Bureau of Reference on methods of identification of irradiated foods. Final report. BCR-Information. 1994, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1994, (Report EUR/15261/en), 1-119.

[22] Delincee, H.: Detection of irradiated food using simple screening methods. Food Sci.Technol.Today, 1994,8,109-110.

[23] Delincee, H., Funk, P., and Roig, D.: Fortschritte bei der Entwicklung von einfachen Schnelltests fur bestrahte Lebensmittel: Lebensmittelbestrahlung, 4. Deutsche Tagung. Edited by Brockmann, A., Erning, D., Helle, N., Schreiber, G. A. Bericht des Instituls fur Sozialmedizin und Epidemiologie des Bundesgesundheitsamtes, 1994, Berlin: Bundesgesundheitsamt, SozEp-Heft 5/1994, 149-157.

[24] Delincee, H.: Rapid and simple screening test to detect the radiation treatment of food. Radiat.Phys.Chem, 1995, 46, 677-680.

[25] Delincee, H.: DNA “Comet Assay” for rapid detection of irradiated food. Acta Alimentaria, 1996, 25, 319-321.

[26] Koppen, G., and Cerda, H.: Identification of low-dose irradiated seeds using the neutral comet assay. Lebensm. Wiss.Technol., 1997, 30, 452-457.

[27] Cerda, H.: Detection of irradiated fresh chicken, pork and fish using the DNA “Comet Assay”. Lebensm.Wiss.Technol., 1998, 31, 89-92.

[28] Khan, H.M., and Delincee, H.: Detection of Irradiation Treatment of Food Using DNA “Comet Assay”. Radiat. Phys. Chem., 1998, 52, 141-144.

[29] Villavicencio, A.L.C.H., Mancini-Filho, J., and Delincee, H: Application of different techniques to identify the effects of irradiation on Brazillan beans after six months storage. Radiat, Phys. Chem. 1998, 52, 161-166.

[30] Delincee, H.: Detection of Irradiated Food: DNA Fragmentation in Grapefruits. Radiat, Phys. Chem. 1998, 52, 135-139.

[31] Rupp, H., and Zoller, 0.: Nachweis von Lebensmittelbestrahlung mittels Mikroelektrophoreseverfahren, 2001, in preparation.

[32] Khan, A.A., and Delincee, H.: DNA “Comet Assay” for detection of irradiated food: 5. Deutsche Tagung Lebensmittelbestrahlung. Edited by Knorr, M., Ehlermann, D.A.E., and Delincee, H., Berichte der Bundesforschungsanstalt fur Ernahrung. 1999, Karlsruhe: Bundesforschungsanstalt fur Ernahrung, BFE-R-99-01, 216-221.

[33] Delincee, H.: Silver staining of DNA in the “Comet Assay”. Comet Newsletter, July 1995.

[34] Cerda, H.: DNA silver staining after elecrtrophoresis in agarose gels: Changes in DNA for the detection of irradiated food. Edited by Delincee, H., Marchioni, E., and Hasselmann, C. BCR- Information. 1993, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993, (Report EUR/15012/en), 6.

[35] Kent, C.R.H., Eady, J.J., Ross, G.M., and Steel, G.G.: The comet moment as a measure of DNA damage in the comet assay, Int.J.Radiat.Biol., 1995, 67, 655-660.

[36] Hellman, B., Vaghef, H., and Bostrom, B.: The concepts of tail moment and tail inertia in the single cell gel electrophoresis assay. Mutat. Res., 1995, 336, 123-131.

[37] Cerda, H., and Koppen, G.: DNA degradation in chilled fresh chicken studied with the neutral comet assay. Z.Lebensm.Unters.Forsch. A, 1998, 207, 22-25.

[38] Cerda, H., and Delincee, H.: Indentification of irradiated seeds using the comet assay, 2001, in preparation.