Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12601:2018 EN 15782:2009 Thức ăn chăn nuôi - Xác định nicarbazin

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12601:2018

EN 15782:2009

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH NICARBAZIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs - Determination of nicarbazin - High-performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 12601:2018 hoàn toàn tương đương với EN 15782:2009;

TCVN 12601:2018 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH NICARBAZIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs - Determination of nicarbazin - High-performance liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng nicarbazin bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và premix (nồng độ tối đa nicarbazin là 2,5 %) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nicarbazin là một hỗn hợp đẳng mol 1:1 của 4,4'-dinitrocarbanilide (DNC) và 4,6-dimetyl-2-pyriminol (HDP). Nicarbazin thường được xác định với cách sử dụng DNC làm hợp chất đích. Phương pháp này phát hiện phần DNC của nicarbazin.

Giới hạn định lượng là 20 mg/kg. Giới hạn phát hiện là 0,5 mg/kg.

CHÚ THÍCH: Giới hạn định lượng có thể thấp hơn, nhưng cần được xác nhận bởi người sử dụng.

2  Nguyên tắc

Chiết mẫu bằng hỗn hợp axetonitril/metanol. Đối với mẫu thức ăn chăn nuôi khi chiết cần phải bổ sung nước. Phần dung dịch chiết mẫu được phân tích bằng phương pháp HPLC pha đảo đẳng dòng, đo phần 4,4'-dinitrocarbanilide ở bước sóng 350 nm.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại phân tích, trừ khi có quy định khác.

3.1  Nước, điện trở >10 MOhm.cm^-1.

3.2  Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho HPLC.

3.3  Metanol (CH₃OH), loại dùng cho HPLC.

3.4  Dung môi chiết

Trộn 500 ml axetonitril (3.2) với 500 ml metanol (3.3). Trộn đều bằng máy khuấy từ và thỏi từ.

3.5  Dung dịch pha động

Trộn 650 ml axetonitril (3.2) với 350 ml nước (3.1). Trộn đều bằng máy khuấy từ và khử bọt khí (ví dụ dùng heli) trước khi sử dụng.

3.6  Chất chuẩn nicarbazin

3.7  Các dung dịch chuẩn

3.7.1  Dung dịch chuẩn nicarbazin gốc, 100 µg/ml

Cân 10 mg chất chuẩn nicarbazin (3.6) chính xác đến 0,1 mg, hòa tan vào 100 ml dung môi chiết (3.4). Để giúp hòa tan, nên sử dụng bể siêu âm khoảng 5 min, trộn đều chất chuẩn. Dung dịch này ổn định trong 24 h khi được bảo quản dưới ánh sáng dịu ở điều kiện bình thường hoặc trong tủ lạnh (xem Chú thích 1).

CHÚ THÍCH 1: Độ tan của chuẩn nicarbazin đối chứng trong dung môi chiết là rất quan trọng. Nồng độ nicarbazin trong dung dịch chuẩn gốc phải được xác nhận bằng cách sử dụng máy quang phổ có cuvet như dưới đây. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 10 µg/ml bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc đã chuẩn bị (3.7.1) với axetonitril. Đo phổ UV-Vis trong dải từ 220 nm và 450 nm sử dụng hỗn hợp metanol/axetonitril (5:95 thể tích) làm dung dịch so sánh. Giá trị hấp thụ lớn nhất đo được giữa 340 nm và 350 nm phải nằm trong giới hạn ± 5 % giá trị mặc định. Giá trị mặc định nên được thiết lập tại chính phòng thí nghiệm bằng cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn lặp lại và đo phổ UV-Vis như trên. Giá trị mặc định là kết quả trung bình của các dung dịch lặp lại đó.

CHÚ THÍCH 2: Nicarbazin rất nhạy với ánh sáng. Để tránh sự phân hủy, trong quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích, luôn bảo vệ các mẫu và dịch chiết tránh ánh sáng.

3.7.2  Các dung dịch chuẩn làm việc nicarbazin

Chuẩn bị một loạt các dung dịch chuẩn làm việc có chứa lần lượt: 0 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 2 µg/ml; 5 µg/ml và 10 µg/ml nicarbazin bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc (3.7.1) với dung môi pha động (3.5). Dung dịch chuẩn làm việc phải được chuẩn bị trong ngày sử dụng.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các trang thiết bị thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm:

4.1.1  Bộ bơm mẫu tự động hoặc dụng cụ bơm mẫu bằng tay, dung tích 20 µl.

4.1.2  Máy bơm, điều chỉnh được tốc độ dòng dung dịch rửa giải ổn định ở 1,0 ml/min.

4.1.3  Cột HPLC, 250 mm 4,6 mm nhồi bằng RP C18, cỡ 5 µm hoặc tương đương.

CHÚ THÍCH: Nên sử dụng cột Nova-Pak hoặc Bonda-Pak, nhưng cũng có thể sử dụng các cột khác với điều kiện là phải tách được DNC.

4.1.4  Detector, cho phép đo độ hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 350 nm.

4.2  Máy lắc cơ (ví dụ máy lắc xoay, máy lắc tay hoặc tương đương).

4.3  Bộ vi lọc để lọc mẫu, cỡ lỗ 0,2 µm đến 0,5 µm

4.4  Bể siêu âm.

4.5  Nồi cách thủy, duy trì nhiệt độ ở 50 °C ± 2 °C.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497).

Điều quan trọng là mẫu phòng thí nghiệm nhận được phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

6  Chuẩn bị mẫu thử

6.1  Yêu cầu chung

Cần phải nghiền và trộn các mẫu thức ăn hỗn hợp trước khi phân tích. Nghiền mẫu thức ăn chăn nuôi bằng máy nghiền cỡ lỗ 1 mm. Sau khi nghiền, trộn đều toàn bộ mẫu. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng ở dưới ánh sáng yếu dịu. Đối với mẫu premix thì không cần nghiền.

CHÚ THÍCH: Nicarbazin rất dễ bị phân hủy bởi ánh sáng. Để tránh sự phân hủy trong quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích, luôn bảo vệ mẫu và dịch chiết tránh ánh sáng.

6.2  Trộn mẫu thử trước khi cân

Hộp đựng mẫu chỉ nên chứa tối đa 50 % dung tích của hộp. Cầm hộp đựng mẫu ở tư thế nằm ngang và thực hiện xoay lật ngược phần dưới hộp lên trên và phần trên hộp xuống dưới, xoay tròn quanh trục ảo dọc tâm của hộp trong thời gian 30 s. Đặt hộp đựng mẫu ở tư thế thẳng đứng và đợi vài giây để bụi lắng xuống.

6.3  Mẫu thêm chuẩn, 100 mg/kg

Lấy 2,5 ml dung dịch chuẩn gốc (3.7.1) cho vào một lọ đựng mẫu hoặc một bình. Cho bay hơi để giảm thể tích (đến dưới 0,5 ml) bằng cách thổi nhẹ khí nitơ, thêm 2,5 g mẫu trắng, trộn đều kỹ và đợi 10 min trước khi bắt đầu công đoạn chiết bằng cách cho nước vào cho mẫu để trương nở (xem 7.2.2).

7  Cách tiến hành

7.1  Yêu cầu chung

Thực hiện việc phân tích trong ngày làm việc.

7.2  Chiết

7.2.1  Premix

Lấy 1 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào bình định mức 200 ml. Thêm 80 ml dung môi chiết (3.4), đóng nắp bình và trộn bằng tay bằng cách xoay bình.

Đặt bình vào nồi cách thủy 50 °C (4.5) trong ít nhất 15 min, sau 8 min thì xoay bình để trộn.

Lắc đều bình 15 min bằng máy lắc (4.2).

Đặt bình vào trong bể siêu âm (4.4) và xử lý bằng siêu âm 15 min.

Làm mát đến nhiệt độ phòng, thêm dung môi pha động (3.5) đến vạch và trộn.

Để cho các hạt rắn của mẫu lắng xuống (tối thiểu 30 min).

Nếu cần phải pha loãng, thì pha các mẫu bằng dung môi pha động (3.5) đến nồng độ nicarbazin cuối cùng nằm trong dải làm việc của dung dịch chuẩn (3.7.2).

Lọc một phần dung dịch pha loãng cuối cùng qua bộ vi lọc (4.3) để phân tích bằng HPLC.

7.2.2  Thức ăn chăn nuôi

Cân 2,5 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml loại dùng một lần hoặc cho trực tiếp vào bình định mức 100 ml.

Thêm 5 ml nước. Chú ý làm ướt toàn bộ mẫu.

Chờ ít nhất 10 min.

Thêm 35 ml dung môi chiết (3.4), đậy nắp ống ly tâm hoặc bình và trộn bằng tay bằng cách xoay ống hoặc bình.

Đặt ống hoặc bình vào nồi cách thủy ở nhiệt độ 50 °C (4.5) 15 min, sau 8 min thì xoay bình để trộn.

Trộn 15 min bằng máy lắc (4.2).

Đặt ống hoặc bình vào bể siêu âm (4.4) và xử lý bằng siêu âm 15 min.

Nếu sử dụng ống ly tâm dùng một lần, chuyển hết lượng dịch chiết mẫu vào bình định mức 100 ml, dùng dung môi pha động (3.5) để tráng ống và thêm dung dịch này đến vạch, trộn.

Nếu cần pha loãng thì để cho các hạt rắn của mẫu lắng xuống (tối thiểu 30 min) rồi pha loãng bằng dung môi pha động (3.5) đến nồng độ nicarbazin cuối cùng nằm trong giới hạn của đồ thị hiệu chuẩn.

Lọc một phần dung dịch pha loãng cuối cùng qua bộ vi lọc (4.3) để phân tích bằng HPLC.

CHÚ THÍCH: Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi không đồng nhất, thì tăng lượng mẫu đến 10 g, đồng thời tăng lượng dung môi chiết tương ứng.

7.3  Xác định bằng HPLC

7.3.1  Các điều kiện HPLC

Các điều kiện sau đây được đưa ra trong hướng dẫn, các điều kiện khác có thể được sử dụng miễn là cho kết quả tương đương.

Kiểm tra tính ổn định của hệ thống sắc ký, bơm vài lần dung dịch chuẩn (3.7.2) 1,0 µg/ml vào hệ thống, cho đến khi đạt được độ ổn định của diện tích các pic và thời gian lưu.

7.3.2  Dựng đường chuẩn

Bơm từng dung dịch chuẩn (3.7.2) để xác định diện tích pic/chiều cao pic tương ứng với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn với trục tung là giá trị diện tích/chiều cao các pic của các dung dịch chuẩn, trên trục hoành là nồng độ tương ứng, µg/ml, của dung dịch chuẩn.

7.3.3  Dung dịch mẫu thử

Bơm mẫu đã chiết (7.2.1 hoặc 7.2.2) ít nhất 2 lần vào hệ thống sắc ký, thể tích mẫu bơm tương tự như thể tích dung dịch chuẩn và xác định diện tích/chiều cao pic DNC.

8  Tính và biểu hiện kết quả

Tính hàm lượng nicarbazin có trong mẫu thử, w_E, biểu thị bằng mg/kg theo công thức sau:

Trong đó:

V_e là thể tích dịch chiết, tính bằng mililit, cụ thể là 200 đối với premix (7.2.1) và 100 đối với thức ăn chăn nuôi (7.2.2);

ρ_n là hàm lượng nicarbazin trong dịch chiết mẫu, µg/ml;

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam;

f_d là hệ số pha loãng đã áp dụng để chuẩn bị dịch chiết mẫu cuối cùng.

9  Độ chụm

9.1  Nghiên cứu cộng tác

Chi tiết nghiên cứu cộng tác của phương pháp này được tóm tắt trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ nghiên cứu cộng tác này có thể không áp dụng cho dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã cho.

9.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một vật liệu thử trong cùng một phòng thí nghiệm do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

9.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp trên cùng một vật liệu thử nghiệm trong các phòng thí nghiệm khác nhau với các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

9.4  Độ thu hồi

Độ thu hồi đạt được đối với thức ăn hỗn hợp phải nằm trong dải từ 90 % đến 110 % mức bổ sung, trong khoảng 20 mg/kg và 200 mg/kg.

10  Báo cáo kết quả thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải ghi rõ:

a) Thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) Phương pháp lấy mẫu được sử dụng, nếu biết;

c) Phương pháp thử được sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về bất kỳ sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả nghiên cứu liên phòng thí nghiệm

Một nghiên cứu liên phòng thí nghiệm của Châu Âu gồm 19 phòng thí nghiệm ở 8 quốc gia được thực hiện trên các mẫu:

Mẫu A: thức ăn cho gà thịt I, 6 % chất béo;

Mẫu B: thức ăn cho gà thịt II, 1 % chất béo;

Mẫu C: thức ăn cho gà thịt II, 11 % chất béo;

Mẫu D: thức ăn cho gà thịt I, 6 % chất béo;

Mẫu E: premix làm thức ăn cho gà thịt.

Phép thử nghiệm này được Viện Kiểm định Chất lượng Sản phẩm Nông nghiệp của Hà Lan (RIKILT) tổ chức thực hiện năm 2000 và các kết quả thu được đã được phân tích thống kê. Dữ liệu về độ chụm được đưa ra trong bảng A.1.

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ISO 6497, Animal feeding stuffs - Sampling (ISO 6497:2002)

[2] ISO 6498, Animal feeding stuffs - Preparation of test samples

[3] ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987)

[4] J.J.M. Driessen, M.J.H. Tomassen and J. de Jong, CANFAS - Collaborative study for the determination of nicarbazin in feedingstuffs and premixtures by HPLC, Report 2002.012, state Institute for Quality Control of Agricultural Products (RIKILT), 2002

[5] J.J.M. Driessen, M.J.H. Tomassen and J. de Jong, CANFAS - 2nd Collaborative study for the determination of nicarbazin in feedingstuffs and premixtures by HPLC, Report 2002.007, State Institute for Quality Control of Agricultural Products (RIKILT), 2002

[6] EU project 'Development and validation of HPLC methods for the official control of coccidiostats and antibiotics used as feed additives', CANFAS-SMT-4-CT98-2216

[7] Jacob de Jong et al., Liquid chromatographic method for nicarbazin in broiler feeds and premixtures: Development, validation, and interlaboratory study, J. of AOAC Int., 87, 6, 1269 - 1277, 2004.